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。2013年3月15日；339(6125):1323-8.
doi:10.1126/science.1228792。 Epub 2013年2月21日。

通过mTOR和S6K1的生长信号刺激从头合成嘧啶

伊萨姆·本·萨赫拉 1, 杰西卡·豪厄尔, 约翰·M·阿萨拉, 布伦丹·D·曼宁
附属公司

通过mTOR和S6K1的生长信号刺激从头合成嘧啶

伊萨姆·本·萨赫拉等。 科学类。 。

摘要

细胞生长信号刺激合成代谢过程。雷帕霉素复合物1（mTORC1）的机制靶点是一种蛋白激酶，它能感应生长信号来调节合成代谢生长和增殖。mTORC1的激活导致通过从头合成嘧啶途径急性刺激代谢流量。mTORC1信号转导通过其下游靶核糖体蛋白S6激酶1（S6K1）调节这一代谢途径，S6K1直接磷酸化CAD上的S1859（氨甲酰磷酸合成酶2、天冬氨酸转氨甲酰酶、二氢orotase），该酶催化从头合成嘧啶的前三步。因此，通过mTORC1的生长信号刺激新核苷酸的产生，以适应核糖体生物生成和合成代谢生长所需的RNA和DNA合成的增加。

PubMed免责声明

利益冲突声明

所有作者都审查了手稿，并宣布没有任何竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。mTORC1对N-氨甲酰天冬氨酸丰度的影响
(A-C公司)来自Tsc2型+/+和Tsc2型-/-MEF在无血清条件下生长15小时，并用载体（DMSO）或雷帕霉素（20 nM）处理。LC/MS/MS分析了每种情况下三个独立样本的细胞内代谢物Tsc2型-/-相对于Tsc2型+/+单元格(A类)或在中减少Tsc2型-/-15小时内(B类)或1小时(C类)雷帕霉素治疗显示为根据p值排列的行正常化热图。这些样品的完整代谢物特征见表S1。(D类)的示意图从头开始嘧啶合成途径和碳氮源并入嘧啶环（见下文）。(E、 F类)通过LC/MS/MS测定mTORC1抑制剂对N-氨甲酰天冬氨酸稳态水平的影响Tsc2型-/-稳定表达K-Ras的MEFs（E）或MCF10A细胞G12伏或PI3KCAH1047R型（F） 在血清饥饿15小时和雷帕霉素（20 nM）或二甲基亚砜治疗1小时后。(G公司)如上所述，在血清饥饿15 h并用强力霉素（1μg/mL）或雷帕霉素（20 nM）治疗最后8 h后，在稳定表达强力霉素诱导PTEN的U87MG细胞中测量N-氨甲酰天冬氨酸水平(E-G公司)数据显示为三份样品的平均值±SEM，免疫印迹如下。MetaboAnalyst和GENE-E软件用于协助代谢物数据分析。全部P（P）-两两比较的值使用双尾Student’st吨测试(N个=3）。
图2
图2。mTORC1基因或胰岛素刺激激活对代谢流量的影响从头开始嘧啶合成途径
(A类)标准化峰面积15N-标记代谢物，通过LC/MS/MS测量，提取自Tsc2型+/+和Tsc2型-/-MEF在无血清条件下生长15小时，在过去1小时内使用载体（DMSO）或雷帕霉素（20 nM）治疗，并在15分钟内脉冲标记15N-谷氨酰胺。(B类)标准化峰面积15来自野生型MEF的N标记代谢物如上所述处理，但在需要时用胰岛素（100 nM）刺激1小时。(C类)标准化峰值面积13C标记的代谢物来自按（A）处理的细胞，但15分钟脉冲标记为[4-13C] -提取代谢物前的天冬氨酸。(D类)单峰归一化峰面积13来自如（A）中处理但雷帕霉素处理1小时或15小时和15分钟的细胞的C-标记代谢物，用[1，2脉冲标记-13C] -提取代谢物之前的葡萄糖。(A-D公司)所有数据均以每种条件下三个独立样本的平均值±SEM表示*P（P）使用双尾学生的成对比较<0.05t吨测试(N个=3），所有P（P）-表S3中提供的值。
图3
图3。CAD作为S6K1的直接基板
(A类)胰岛素和雷帕霉素对CAD磷酸化位点的影响。在用胰岛素刺激（3 h，50 nM）之前，用二甲基亚砜或雷帕霉素（20 nM）处理1h，从缺血清（16 h）的HEK-293E细胞中免疫纯化FLAG-HA-CAD。绘制了不同条件下CAD上指示位点的磷酸化与总肽水平的比值，通过LC/MS/MS测量为总离子电流（TIC）。ND=未检测到磷酸肽。(B类)表达空载体（EV）或野生型（WT）、S1859A或S1900A版本的FLAG-HA-CAD的HEK-293E细胞被血清饥饿（16 h）并用胰岛素刺激（1 h，100 nM）。用磷酸-14-3-3结合基序抗体（P-Ser基序）对FLAG免疫沉淀物进行免疫印迹。(C类)细胞按（B）处理，但在胰岛素刺激前用雷帕霉素（20 nM）或S6K1抑制剂PF-4708671（10μM，S6K1i）预处理1 h。(D类)细胞按（C）处理，但也转染靶向S6K1、S6K2或两者的siRNA，或非靶向对照（siCtl）。(电子)体外用血清饥饿、雷帕霉素处理的HEK-293E细胞免疫沉淀的FLAG-HA-CAD底物（WT或S1859A）和胰岛素刺激的HEK-29.3E细胞的HA-S6K1（WT or kinase dead，KD）免疫沉淀进行激酶分析。(F类)在用胰岛素（100 nM）或EGF（20 ng/mL）刺激1小时之前，对Hela细胞进行血清饥饿（16小时），并用雷帕霉素、S6K1i或MEK抑制剂U0126（10μM）预处理1小时。
图4
图4。S6K1和S1859对mTORC1依赖性刺激的CAD要求从头开始嘧啶合成途径
(A类)标准化峰面积15在DMSO、雷帕霉素（20 nM）或PF-4708671（10μM，S6Ki）存在下，从缺乏血清（15 h）和胰岛素刺激（1 h，100 nM）的WT-MEFs中提取的N标记代谢物，通过LC/MS/MS测定，15分钟脉冲标记为15N-谷氨酰胺。(B类)标准化峰面积15转染靶向S6K1、S6K2或两者的siRNAs或非靶向对照（siCtl）的WT MEF的N标记代谢物在转染后48小时进行处理，如（A）所示。(C类)放射性标签的相对合并14C-天冬氨酸，三H-尿苷或三如（B）所示，将H-胸腺嘧啶核苷转染到转染siRNAs的WT MEF的RNA和DNA中，血清饥饿（15 H），胰岛素刺激（6 H，100 nM），在此期间对细胞进行放射标记。(D类)放射性标签的相对合并14C-天冬氨酸或三H-尿苷从WT MEF转化为rRNA，如（C）所述。纯化的rRNA也在琼脂糖凝胶上进行了评估（右）。(电子)标准化峰面积15表达CAD WT的G9C细胞中的N-标记代谢物或如（a）中处理的S1859A突变体。ND=未检测到代谢物。(A-E公司)所有数据均以每种条件下三个独立样本的平均值±SEM表示*P（P）使用双尾学生的成对比较<0.05t吨测试(N个=3），所有P（P）-表S4中提供的值。
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