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.2013年2月5日；110(6):2157-62.
doi:10.1073/pnas.1201993110。 Epub 2013年1月25日。

APR-246/PRIMA-1（MET）拯救p63突变的EEC综合征患者皮肤角质形成细胞的表皮分化

沈金凤 1, 埃伦·范登·博加德, 伊芙琳·考文霍温, 弗拉基米尔·J·N·拜科夫, Tuula Rinne公司, 张强, 锗烷S Tjabringa, 克里斯蒂安·吉利森, 西蒙·范·海林根, 乔斯特·沙尔克维克, 汉斯·范博霍文, 克拉斯·G·维曼, 周慧卿
附属机构

APR-246/PRIMA-1（MET）挽救具有p63突变的EEC综合征患者皮肤角质形成细胞的表皮分化

沈金凤等人。 美国国家科学院程序. .

摘要

p53和p63具有广泛的序列和结构同源性。p53在癌症中经常发生突变，而p63的突变会导致发育障碍，表现为外胚层发育不良、肢体缺陷和口唇裂。我们已经建立了具有p63突变的手指缺失、外胚层发育不良和唇腭裂（EEC）综合征患者的原代成人皮肤角质形成细胞作为体外人类模型，以研究EEC患者皮肤的疾病机制。我们发现，这些在浸没的2D培养物或3D皮肤等效物中培养的患者角质形成细胞具有受损的表皮分化和分层。用突变的p53靶向化合物APR-246/PRIMA-1（MET）治疗这些患者角质形成细胞（p53活化和诱导大量凋亡）这已在癌症患者的一期/二期临床试验中成功测试，在2D和3D模型的表皮分层过程中，部分但始终保留了形态学特征和基因表达。这一拯救与p63靶基因表达的恢复一致。我们的数据表明，具有p63突变的EEC患者角质形成细胞可用于表征患者皮肤中的异常分子回路，并可能为设计针对突变p63相关发育异常患者的新型药物治疗策略提供可能性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：K.G.W.和V.J.N.B.是Aprea AB的联合创始人和股东，该公司开发基于p53的癌症治疗，包括APR-246。K.G.W.是其董事会成员。

数字

图1。
图1。
EEC患者携带角质形成细胞的表达分析第63页发现的突变ADH7型作为潜在的p63靶基因之一。(A类)三种EEC患者角质形成细胞培养物中差异表达基因与对照组的重叠（方差分析P（P）< 0.05). (B类)热图显示328个差异调节基因的表达模式。用黑色条表示的p63结合位点显示在heatmap的右侧。(C类)附近有两个结合位点ADH7型使用ChIP-qPCR验证（BS1，BS2）（24）。IRF6附近的p63结合位点作为阳性对照，肌红蛋白外显子2和11号染色体上的无基因区域作为阴性对照。(D类)ΔNp63α通过野生型ADH7 BS1和带有突变p63结合基序的BS1进行反激活。
图2。
图2。
APR-246治疗的EEC患者角质形成细胞中的分化标记物表达。控制，R204W(A类)和R304W(B类)用APR-246处理的角质形成细胞进行分化标记物染色。（放大倍数：40×。）在分化第7天收集R304W角质形成细胞。细胞核用蓝色DAPI染色。(C类)通过蛋白质印迹法分析经APR-246处理的对照组和R204W角质形成细胞的蛋白裂解物中的Involucrin、p63和β-actin（负荷对照）。
图3。
图3。
APR-246处理后p63靶基因的表达。(A类)RT-qPCR分析ADH7型经APR-246处理的R304W和R204W角质形成细胞在不同分化阶段的表达。(B类)APR-246处理的R204W角质形成细胞被Claudin-1染色（绿色）。（放大倍数：63×。）细胞核用DAPI（蓝色）染色。(C类)mRNA诱导（RT-qPCR，左侧)和蛋白质（流式细胞术，对)所有测试基因（GPX2、ADH7、K10、CysMe、involucrin和K1代表mRNA，K10、TGM、K1、Claudin-1和involugrin代表蛋白质）的7天以上分化如箱-刷图所示。野生型p63细胞中mRNA或蛋白质的表达水平设置为100%。(左侧)配对的吨未经处理的细胞和APR-246处理的细胞之间的测试表明，R304W角质形成细胞的挽救达到了统计学意义(P（P）=0.025），但在R204W角质形成细胞中没有(P（P）= 0.22). (对)配对的吨试验表明，与未经处理的细胞相比，经15µM APR-246处理的R304W细胞有显著的挽救作用(P（P）=0.0796，根据Wilcoxon配对检验）。
图4。
图4。
经APR-246处理的3D人体皮肤等效物中的分化标记表达。(A类)在气液界面培养中用APR-246处理p63野生型和R204W角质形成细胞生成的人皮肤等效物用H&E和ADH7抗体染色。(B类)通过对野生型角质形成细胞和经APR-246处理的R204W和R304W角朊细胞生成的皮肤等效物进行免疫荧光染色，检测K10、Involucrin和CysME的蛋白表达。细胞核用DAPI（蓝色）染色。（比例尺，50μM。）
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