In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration

doi:10.1038/nature11826

.2013年2月14日；494(7436):247-50.

doi:10.1038/nature11826。 Epub 2013年1月27日。

Wnt驱动再生诱导单个Lgr5+肝干细胞体外扩增

Meritxell Huch公司¹, 克雷格·多雷尔, Sylvia F Boj公司, 约翰·H·凡·埃斯, 维维安·S·W·李, 马克·范德韦特林, 佐藤俊郎, 卡里安·哈默, 佐佐木信夫, 米尔顿·J·费内戈尔德, 安妮莉丝·哈夫特, 罗伯特·G·弗里斯, 马库斯·格伦佩, 汉斯·克利夫斯

附属公司

PMID： 23354049
预防性维修识别码：项目经理3634804
内政部： 10.1038/自然11826

Wnt驱动再生诱导单个Lgr5+肝干细胞体外扩增

Meritxell Huch公司等。自然. 2013.

.2013年2月14日；494(7436):247-50.

doi:10.1038/nature11826。 Epub 2013年1月27日。

作者

Meritxell Huch公司¹, 克雷格·多雷尔, Sylvia F Boj公司, 约翰·H·凡·埃斯, 维维安·S·W·李, 马克·范德韦特林, 佐藤俊郎, 卡里安·哈默, 佐佐木信夫, 米尔顿·J·费内戈尔德, 安妮莉丝·哈夫特, 罗伯特·G·弗里斯, 马库斯·格朗普, 汉斯·克利夫斯

附属

¹荷兰乌得勒支大学医学中心发育生物学和干细胞研究所。

PMID： 23354049
预防性维修识别码：项目经理3634804
内政部： 10.1038/自然11826

摘要

Wnt靶基因Lgr5（亮氨酸-富重复G-蛋白偶联受体5）标志着Wnt驱动的自我更新组织（如小肠和结肠、胃和毛囊）中干细胞的积极分裂。三维培养系统可以将单个Lgr5（+）干细胞长期克隆扩增为可移植的器官样体（出芽囊肿），保留原始上皮结构的许多特征。培养基的一个关键成分是Wnt激动剂RSPO1，这是最近发现的LGR5配体。在这里，我们发现Lgr5-lacZ在健康成人肝脏中不表达，然而，损伤后胆管附近出现小的Lgr5-lacZ（+）细胞，与Wnt信号的强烈激活相一致。如使用新的Lgr5-IRES-creERT2敲除等位基因的小鼠谱系追踪所示，损伤诱导的Lgr5（+）细胞在体内产生肝细胞和胆管。来自受损小鼠肝脏的单个Lgr5（+）细胞可以在几个月内在基于Rspo1的培养基中克隆扩增为类有机物。这种克隆类有机物可以在体外诱导分化，并在移植到Fah（-/-）小鼠后生成功能性肝细胞。这些发现表明，先前关于主动自我更新组织中Lgr5（+）干细胞的观察也可以扩展到自发增殖率低的组织中损伤诱导的干细胞。

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竞争性金融利益

MH和HC是与此工作相关的专利申请的发明人。

数字

**图1。肝损伤导致Lgr5⁺双潜能肝祖细胞**
**a–b**,*Lgr5-LacZ公司*小鼠IP注射玉米油（n=6）**（a）**或玉米油中单剂量CCl4（1ml/kg）（n=6）**（b）**六天后，处死小鼠，收集肝脏进行β-半乳糖染色。一，未受损肝脏不表达*Lgr5-LacZ公司。* b条,CCl4上，强*Lgr5-LacZ公司*在导管附近的小细胞中检测到表达。比较Lgr5-LacZ⁺细胞（箭头）与相邻肝细胞（星号，*）。比例尺，200μm（顶部面板）和30μm（底部面板）。**c（c）**,*Lgr5-ires-CreERT2型*小鼠与*Rosa26R-LacZ公司*Cre报告鼠。后代接受CCl4的单次IP注射，2天后用三苯氧胺（3mg/只小鼠）诱导CreERT2活性，如方案所示。显示CCl4损伤时Lgr5细胞谱系追踪的代表性图片（n=8）。比较LacZ之间的大小差异⁺三苯氧胺诱导后第2天和第4天的细胞（箭头）和肝细胞（星号*）。每一天的精彩程度都是一样的。比例尺，500μm（顶部面板）和50μm（底部面板）。d日,*Lgr5-ires-CreERT2型*x个*Rosa26-LacZ公司*用DDC喂养后代（n=3），4和6天后用三苯氧胺诱导CreERT2活性，如方案所示。显示阳性肝细胞的典型图片(d日′）和阳性导管细胞(d日″). 坦，他莫昔芬。比例尺，200μm(d日)，25微米(d日′）和50μm(d日″).

**图2。体外从成人肝组织中扩增单个Lgr5细胞**
**a–c，** *Lgr5-LacZ公司*如图1所示，向小鼠注射玉米油或CCl4（IP）。6天后，将肝组织分离为单个细胞，负载荧光CMFDGβ-半乳糖苷酶底物，并进行FACS分析。分选的分离Lgr5-LacZ+细胞以1个单细胞的比例培养*Lgr5-LacZ公司⁺*阳性细胞/微孔（克隆），如补充方法所述。一，表示所用协议的方案。b条，CCl4处理（CCl4+）和非处理（无CCl4）肝脏分离单个细胞的典型FACS图。通过细胞大小（FSC vs SSC）和PI排除进行顺序选择后，对细胞进行门控。可行CMFDG⁺圆周率⁻对细胞进行筛选和排序。显示了代表性单元格。**c（c）**，串行DIC图像显示单个*Lgr5-LacZ公司⁺*单元格。原始放大倍数：40倍（0-5天）、20倍（7-11天）、10倍（19天）和4倍（1个月后）。P、通道。

图3。单细胞来源的肝类器官获得肝细胞命运并显示肝细胞功能*体外试验。*
**a–i**克隆Lgr5衍生培养物在扩张培养基（EM）中生长，并在分析之前转移到分化培养基（DM）中8–14天。分析了两种独立的克隆培养物。**a–d**共焦图像（z-stack投影）用于肝细胞特异性标记。一、HNF4α（红色）、白蛋白（ALB）（绿色）和EpCAM（灰色）。b条，MRP4（绿色）。**c（c）**，ZO-1（洋红色）。d日、ALB（红色）KRT19（洋红色）和肝细胞表面标记物OC2-2F8（绿色，补充图8中OC2-2FH标记物的完整描述）。用Hoechst对细胞核进行复染。**e–f，**使用Dil-ac-LDL荧光底物（红色）分析EM培养物中的LDL摄取(**e（电子）**)或DM(**（f）**)持续14天。只有保存在DM中的培养物含有底物（红色）。用DRAQ5对细胞核进行反染色。比例尺，50μm。克，通过PAS染色测定EM或DM中生长10天的类有机物中的糖原积累。图表显示PAS弱阳性或强阳性细胞的百分比。结果显示为10个EM或10个DM非依赖性有机物的10个独立切片的平均值±SEM。小时在EM或DM中保存8天（DM-8d）或13天（DM-13d）的克隆培养物的24h上清液中测定白蛋白（Alb.）分泌。结果以每细胞白蛋白pg表示。我，在DM中保存13天的培养物中测量Cyp3a活性。结果表示为每毫升百万个细胞的RLU。**h–i**分别以MEF、肝细胞（Hep.）和HepG2细胞作为阴性和阳性对照。分析了每种情况下的三种硅酸盐。结果显示为3个独立实验的平均值±SEM。***，p<0.0001。

**图4。克隆性肝器官移植后的肝细胞岛*FAH公司^−/−*-突变小鼠**
来自3个独立克隆的单细胞衍生肝器官在EM下扩增并分化9天，然后移植到*法赫^−/−/抹布2^−/−/Il2Rγ^−/−*(*FRG公司*)老鼠。克隆I（n=8）、克隆II（n=6）、克隆III（n=5）。**a、，**显示移植协议的方案。**b–d，**肝实质内典型阳性移植物。b条，法赫⁺区域（克隆III）。移植细胞对Krt19呈阴性(**c、，**导管标记）和HNF4α阳性(**日期：，**肝细胞标记物）。比例尺，400μm(b条)和100微米(b条′–d日).e、，移植阳性小鼠的Kaplan-Meier生存曲线（棕色曲线，移植物+，n=5）、移植无移植证据的小鼠（蓝色曲线，移生物-，n=9）和非移植对照小鼠（黑色曲线，非移植，n=4）。Plot以线性比例显示累积存活率。Kaplan-Meier生存分析比较了两组的总体生存率。对数秩检验用于比较存活率的差异。*，log-rank=0.02（移植物+与移植物），log-rank=0.007（移植物+与不是透明的）。

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中的注释

Wnt促进肝损伤后干细胞介导的修复反应。
Nejak-Bowen KN，蒙加SP。 Nejak-Bowen KN等人。肝病学。2013年11月；58(5):1847-50. doi:10.1002/hep.26579。Epub 2013年9月19日。肝病学。2013 PMID：23788312 没有可用的摘要。

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1. Jaks V等人。Lgr5标志着毛囊干细胞的周期性，但寿命较长。自然遗传学。2008;40:1291–1299.-公共医学
1. Sato T等。单个Lgr5干细胞在体外构建无间充质龛的隐窝绒毛结构。自然。2009;459:262–265.-公共医学
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[3] Barker N等人Lgr5（+ve）干细胞在胃中驱动自我更新，并在体外构建长寿命的胃单位。细胞干细胞。2010;6:25–36.-公共医学

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[5] Jaks V等人。Lgr5标志着毛囊干细胞的周期性，但寿命较长。自然遗传学。2008;40:1291–1299.-公共医学

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[7] Sato T等。单个Lgr5干细胞在体外构建无间充质龛的隐窝绒毛结构。自然。2009;459:262–265.-公共医学

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[9] Yui S，等。从单个成体Lgr5（+）干细胞体外扩增的结肠上皮功能性植入。《国家医学》2012；18:618–623.-公共医学

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