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.2013年1月17日；152(1-2):340-51.
doi:10.1016/j.cell.2012.12.010。

用p16（INK4a）-荧光素酶模型监测体内肿瘤发生和衰老

克里斯蒂安·E·伯德 1, 杰西卡·索伦蒂诺, 凯利·克拉克, 大卫·B·达尔, 贾纳基拉曼·克里希纳穆尔西（Janakiraman Krishnamurthy）, Allison M交易, 纳比尔·巴迪西, 迭戈·卡斯特里隆, 大卫·H·比奇, 诺曼·夏普莱斯
附属公司

用p16（INK4a）-荧光素酶模型监测体内肿瘤发生和衰老

克里斯汀·伯德等。 单元格. .

摘要

在体内监测癌症和衰老仍然具有实验挑战性。在这里，我们描述了荧光素酶敲除小鼠（p16（LUC）），它忠实地报告了p16（INK4a）的表达，p16是一种肿瘤抑制因子和衰老生物标志物。p16（+/LUC）小鼠的发光寿命评估显示，随着年龄的增长，发光强度呈指数级增加，这在同期饲养的同基因小鼠队列中变化很大。随着年龄增长，p16（INK4a）的表达并不能预测癌症的发展，这表明衰老细胞的积累不是癌症相关死亡的主要决定因素。在14个受试肿瘤模型中的14个中，p16（LUC）的表达被早期肿瘤事件局部激活，使肿瘤可视化的灵敏度超过其他成像方式。在新出现的肿瘤和周围的基质细胞中发现p16（INK4a）的激活。这项工作表明，p16（INK4a）激活是所有新兴癌症的特征，使p16（LUC）等位基因成为肿瘤转化的敏感、无偏见的报告者。

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数字

图1
图1。设计和验证第16页LUC公司阿勒
（A） 的示意图第16页勒克敲门瞄准策略。“+Flp”表示Flp重组介导的新霉素选择盒切除后的靶向等位基因。（B） 诱导第16页墨水4amRNA显示在以3T3计划传代的指定基因型的MEF中。折叠诱导是根据第16页墨水4a第3天的转录水平。所示数据对应于三次重复的生物复制。误差条代表SEM。（C）p19农业研究基金和第16页墨水4a按3T3时间表培养的同窝MEF的western blots，并在指定的时间点收获。（D） 折叠p16墨水4a图（C）中所示的蛋白印迹显示了诱导作用。使用LICOR Odyssey系统对条带进行量化，归一化为总蛋白，并按照（B）进行分析。（E） 所示基因型MEF中的荧光素酶活性，计算结果如（B）所示。误差线为±SEM。（F） 荧光素酶活性与内源性第16页墨水4a中的表达式第16页+/LUC公司MEF按3T3时间表传送。数据表示在多个体外时间点的≥3个生物复制，显示了最佳拟合线和95%置信区间（虚线）。采用线性回归计算p值和相关系数（r）。（G） 哺乳期的代表性2分钟发光图像第16页+/LUC公司小鼠在相对于断奶日期（WD）的指定时间点。（H） 代表性的，2分钟的照片和发光图像第16页+/LUC公司伤口愈合的老鼠。其他相关数据见图S1。
图2
图2。诱导第16页勒克与年龄相关，但与寿命无关
（A） 无毛小鼠的全身荧光素酶活性（SKH1-E）第16页+/LUC公司使用2分钟腹部图像对小鼠进行量化，并绘制出与年龄的关系图（n=32）。蓝线表示每个时间点的中值。80周龄的荧光素酶活性第16页+/+显示小鼠以进行比较。对于统计分析，计算每个时间点的全身发光与第16周的比值。采用Wilcoxon符号秩检验检验每个比率是否显著不同于1。除第24周外，所有比较的p<0.0001（p=0.018）。（B） （A）所示研究中小鼠的代表性系列荧光素酶图像。每2分钟的图像显示相同的老鼠组，排列相同。鼠标2是第16页+/+，而所有其他老鼠都是第16页+/LUC公司.（C）老年人和年轻人后四分之一的皮肤第16页+/LUC公司动物被固定在同一石蜡块中，并接受单分子荧光素酶RNA原位杂交。显示的是来自同一石蜡块的具有代表性的组织图像荧光素酶显示为棕色圆点的消息。原始放大倍数=40×。（D） （A）中所示队列的平均全身荧光素酶活性用蓝色绘制，95%置信区间用虚线表示。以黑色绘制的点表示每只小鼠（n=14）在寿命事件（肿瘤形成死亡）之前的图像中的全身荧光素酶活性。（E） 计算56周龄每只活小鼠的全身荧光素酶活性。使用该时间点的荧光素酶活性中值，将小鼠分为高组和低组。每组的Kaplan-Meier曲线显示了通过使用对数秩检验计算的p值。（F） 通过线性回归，计算每只存活56周的小鼠的荧光素酶增加率。通过使用该时间点的中位数增长率，将小鼠分为高组和低组。显示了各组的Kaplan-Meier曲线，并使用对数秩检验计算了p值。其他相关数据见图S2。
图3
图3。第16页勒克早期标记，新发肿瘤
（A） 代表性序列图像显示第16页LUC公司累积时间第16页+/LUC公司，C3（1）标签+8周内出现肿瘤灶。可见几个局灶性、乳腺和爪子肿瘤。红色方框中突出显示了一个可触及的肿瘤，其大小小于卡尺的测量值。（B） 代表性序列图像显示第16页LUC公司在a处积累第16页−/LUCTRIA公司6周内出现耳肿瘤。（C） 血红素和曙红染色显示TRIA公司耳肿瘤如（B）所示。（D） 血红素和曙红染色显示几乎摸不到的C3（1）标签肿瘤在（A）中突出显示。（E） 触诊或可视化之前在以下肿瘤中观察到荧光素酶活性的天数第16页+/LUC公司C3（1）标签老鼠。数据显示了单个肿瘤的中线检测优势。（F） 触诊或可视化之前的天数，在这些肿瘤中观察到荧光素酶活性第16页−/勒克TRIA公司老鼠。数据描述如（E）所示。（G） 联合Kaplan-Meier分析第16页+/LUC公司C3（1）标签和第16页−/LUCTRIA公司通过发光或触诊对小鼠进行肿瘤检测。显著性通过对数秩检验确定。（H） 荧光素酶图像第16页+/勒克C3（1）标签早期乳腺肿瘤小鼠（腹部2分钟图像，侧面1分钟图像）。（一） （H）和（J）中小鼠乳腺肿瘤解剖的照片。标尺哈希标记表示1 mm单位。（J） 相同的FDG-PET图像第16页+/LUC公司C3（1）总剂量鼠标如（H）所示。FDG-PET无法显示肿瘤1。参见图S3中的其他支持数据。
图4
图4。第16页LUC公司体内活动检测自发性癌症
（A） （上图）110周龄儿童自发组织细胞恶性肿瘤的检测第16页+/LUC公司鼠标。所有显示的发光图像长度均为1分钟，但腹侧图像长度为2分钟。成像后立即拍摄器官图像。（下图）血红素和曙红染色的固定组织证实脑和肝脏荧光素酶阳性区域存在恶性肿瘤。（B） （上图）78岁儿童自发播散性肺腺癌的发光检测第16页+/LUC公司鼠标。图像生成如（A）所示，组织学证实如下。另请参见图S4和表S1。
图5
图5。第16页LUC公司通过非细胞自主机制发出癌症活动信号
（A） 免疫能力，FVB/N第16页+/勒克小鼠按同基因所示进行原位注射第16页+/+C3（1）标签细胞单独存在于基质凝胶或基质凝胶载体中，并在肿瘤形成时成像。图中显示了具有代表性的2分钟图像。（B） 同系的第16页+/+胸部(MMTV-HER2/中性粒细胞和K14-CRE p53型洛克斯/洛克斯)，胰腺(Pdx-CRE LSL-K-ras公司G12D系列第53页洛克斯/洛克斯)和子宫内膜(弹簧2f-CRE Lkb1洛克斯/洛克斯)将癌细胞系皮下注射到第16页+/LUC公司小鼠，肿瘤建立后成像。每个模型都显示了具有代表性的2分钟发光图像。（C） 同种异体移植第16页+/LUC公司骨髓进入第16页+/+接受者的行为如图所示。免疫重建后，同基因第16页+/+C3（1）标签将细胞原位移植到小鼠体内，并如（A）所示成像。记录成像时的肿瘤大小。在所有移植瘤中均观察到强大的荧光素酶活性，但仅在注射基质凝胶的对侧部位未观察到。另请参见图S5。
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中的注释

  • 衰老：提高检测能力。
    塞顿·罗杰斯S。 塞顿·罗杰斯S。 Nat Rev癌症。2013年3月；13(3):150. doi:10.1038/nrc3473。Epub 2013年2月14日。 Nat Rev癌症。2013 PMID：23407578 没有可用的摘要。
  • 癌细胞报告。
    Nawy T。 Nawy T。 自然方法。2013年3月；10（3）：195。doi:10.1038/nmeth.2393。 自然方法。2013 PMID：23570043 没有可用的摘要。

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