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.2013年2月；123(2):566-79.
doi:10.1172/JCI65871。 Epub 2013年1月16日。

MicroRNA-374a激活Wnt/β-catenin信号通路促进乳腺癌转移

蔡俊超 1, 关宏宇, 李山芳, 易阳, 朱迅, Jie Yuan先生, 吴菊英, 李梦峰
附属公司

MicroRNA-374a激活Wnt/β-catenin信号通路促进乳腺癌转移

蔡俊超等。 临床研究杂志. 2013年2月.

摘要

肿瘤转移涉及一系列生物学步骤，在此过程中，肿瘤细胞获得侵袭周围组织并在原肿瘤部位以外生存的能力。在早期阶段，癌细胞经历上皮-间充质转化（EMT）。已知Wnt/β-catenin信号传导可驱动EMT和转移。在这里，我们报告了表达microRNA 374a（miR-374a）的转移性乳腺癌细胞中Wnt/β-catenin信号过度激活。在乳腺癌细胞系中，miR-374a的异位过度表达在体内外均能促进EMT和转移。此外，miR-374a直接靶向并抑制Wnt/β-catenin信号级联的多个负调控因子，包括WIF1、PTEN和WNT5A。值得注意的是，miR-374a在远处转移患者的原发肿瘤样本中显著上调，并与无转移生存率低相关。这些结果表明，miR-374a维持组成性激活的Wnt/β-catenin信号通路，可能是早期转移性乳腺癌的治疗靶点。

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数字

图1
图1。miR-374a在转移性乳腺癌细胞系中显著过度表达。
(A类)miRNA阵列分析显示，在亲代MDA-MB-435细胞及其肺转移衍生物中差异表达miRNA。假彩色代表转移性衍生物相对于亲代细胞的强度等级。(B类)实时PCR分析miR-374a在人乳腺癌细胞系中的表达水平，并与原代NBEC和自发永生化MCF10A细胞进行比较。误差条表示3个独立实验的平均值±SD*P（P）< 0.05.
图2
图2。miR-374a的过度表达在体外诱导乳腺癌细胞系的EMT。
(A类)通过相控显微镜评估miR-374a过度表达或抑制对细胞形态的影响。(B类)通过WB分析检测指示细胞中上皮细胞标记物（E-cadherin、γ-catenin和CK18）和间充质细胞标记物的表达（vimentin和N-cadherin）。GAPDH被用作负荷控制。(C类)分别通过Matrigel涂层或非涂层Transwell测定分析的5个随机场中指示的入侵或迁移细胞的定量。(天)在3D球体侵袭试验中，在Matrigel上生长10天的指示细胞的代表性显微照片。(E类)所示细胞伤口愈合试验的代表性显微照片。受伤后0小时和24小时拍摄伤口闭合情况。中的实验A类–E类重复至少3次，结果相似，误差条为C类表示平均值±标准偏差*P（P）< 0.05. 原始放大倍数，A类和天, ×200;E类, ×100. NC，阴性对照。
图3
图3。miR-374a增强体内乳腺癌细胞系的转移。
(A类)典型的肺部亮场成像。在第60天（对于MCF7）、第15天（对于4T1）和第30天（对于MDA-MB-435），麻醉接受指示细胞移植的小鼠并收集肺。箭头表示表面转移结节。(B类)小鼠可见的表面转移病灶数量(n个=每组6个）接受指定细胞的原位注射。(C类)接受指定细胞移植的BALB/c小鼠的原发肿瘤重量。(天)移植有指示细胞的小鼠的转移指数（每原发肿瘤重量的转移数）。(E类)H&E染色证实植入指示细胞的小鼠的肺转移。(F类)原位注射指定细胞的小鼠肺转移的典型生物发光图像。中的错误条B类–天代表平均值±SD(n个=每组6人）*P（P）< 0.05.
图4
图4。Wnt/β-catenin信号转导介导miR-374a的作用。
(A类)β-catenin核转位改变对miR-374a表达解除的反应。通过WB分析对指示细胞的核级分进行分析。EF-1α用作负荷控制。(B类)用免疫荧光染色法评估指示细胞中的亚细胞β-连环蛋白定位。(C类)转染TOPflash或FOPflash和雷尼利亚转染48小时后，对pRL-TK质粒进行双重核糖核酸酶分析。检测到的报告器活动由规范化雷尼利亚荧光素酶活性。(天)WB分析证实miR-374a表达细胞中TCF4或LEF1与特定siRNA的耗竭。(E类)Matrigel-coated Transwell分析中显示入侵细胞的定量。(F类)荧光素酶在指示细胞中报告TCF/LEF转录活性。(G公司)WB分析证实了miR-374a沉默的MDA-MB-435细胞中TCF4或LEF1的过度表达。(H（H）)Transwell分析中TCF4或LEF1过度表达影响的侵袭细胞的定量。(我)荧光素酶在指示细胞中报告TCF/LEF转录活性。中的实验A类–我重复至少3次，结果相似，误差条为C类,E类,F类,H（H）、和我表示平均值±标准偏差*P（P）< 0.05.
图5
图5。WIF1、PTEN和WNT5A是miR-374a的直接靶标。
(A类)WIF1、PTEN和WNT5的3′UTR中推测的miR-374a靶点示意图。(B类)miR-374a-mut序列。(C类)对WIF1、PTEN和WNT5A蛋白水平进行WB分析，以响应指示细胞的miR-374a表达的解除。(天)实时RT-PCR分析WIF1系列,PTEN公司、和WNT5A型在指示的细胞中。(E类)pGL3-WIF1-3′-UTR、pGL3-WNT5A-3′-UTR和pGL3-PTEN-3′-UTRA报告子的荧光素酶分析与MCF7和4T1细胞系中增加数量的miR-374a模拟和突变寡核苷酸（10、20和50 nM）或增加数量的miR-374a抑制剂寡核苷酸（20、50和100 nM）共同转染。中的实验C类–E类重复至少3次，结果相似，误差条为天和E类表示平均值±标准偏差*P（P）< 0.05.
图6
图6。WIF1、PTEN和WNT5A在miR-374a诱导的乳腺癌细胞系侵袭和TCF/LEF转录活性中具有功能性作用。
(A类)WB分析证实在MCF7和4T1细胞中转染WIF1、PTEN或WNT5A靶向siRNA。(B类)用指定的siRNAs转染入侵的MCF7和4T1细胞的定量。(C类)荧光素酶检测转染有指定siRNA的MCF7和4T1细胞的TCF/LEF转录活性。(天)用GAPDH作为负荷对照，通过WB分析确认WIF1、PTEN或WNT5A在指定细胞中的异位表达。(E类)Transwell分析中WIF1、PTEN或WNT5A过度表达对侵袭细胞的定量影响。(F类)显示细胞中TCF/LEF转录活性的荧光素酶分析。(G公司)WB分析证实了miR-374a沉默细胞中特异性siRNA的转染。(H（H）)用特异性siRNA转染定量显示入侵细胞。(我)用特异性siRNA转染的指示细胞中TCF/LEF转录活性的萤光素酶测定B类,C类,E类,F类,H（H）、和我表示3个独立实验的平均值±SD*P（P）< 0.05.
图7
图7。miR-374a与人类乳腺癌转移的临床相关性。
(A类)转移性复发肿瘤miR-374a表达水平的实时RT-PCR分析(n个=33）和无转移的肿瘤(n个= 133). (B类)Kaplan-Meier无转移生存曲线比较2组高（大于平均值；n个=48）和低（小于平均值；n个=116）miR-374a在166名乳腺癌患者的原发性肿瘤中的表达水平；P（P）该值基于log-rank测试。(C类)miR-374a的表达与临床乳腺癌标本中WIF1、PTEN、WNT5A、E-cadherin和N-cadherin的表达水平及β-catenin的定位有关。显示了两个具有代表性的案例。原始放大倍数，×400。(天)与WIF1、PTEN、WNT5A、E-cadherin、N-cadherin和β-catenin的细胞质/核或膜的表达水平相关的miR-374a表达低或高的标本百分比*P（P）< 0.05.
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