Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections

doi:10.1038/nmeth.2332

.2013年2月；10(2):171-7.

doi:10.1038/nmeth.2332。 Epub 2013年1月13日。

在组织学切片中检测单个细胞中特定基因位点的组蛋白修饰

德尔芬·戈麦斯¹, 劳拉·桑克曼, 安·T·阮, 加里·欧文斯

附属公司

PMID： 23314172
预防性维修识别码： PMC3560316型
内政部： 10.1038/nmeth.2332

组织切片中单个细胞特定基因位点组蛋白修饰的检测

德尔芬·戈麦斯等。 Nat方法. 2013年2月.

.2013年2月；10(2):171-7.

doi:10.1038/nmeth.2332。 Epub 2013年1月13日。

作者

德尔芬·戈麦斯¹, 劳拉·桑克曼, 安·T·阮, 加里·欧文斯

附属

¹罗伯特·伯尔尼心血管研究中心，弗吉尼亚大学医学院，美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔。

PMID： 23314172
预防性维修识别码： PMC3560316型
内政部： 10.1038/nmeth.2332

摘要

染色质免疫沉淀分析对我们理解组蛋白修饰在基因调控中的作用有很大贡献。然而，它们不允许使用单细胞分辨率进行分析，从而混淆了异质细胞群的分析。在此，我们提出了一种方法，该方法基于原位杂交和邻近连接分析的联合使用，允许在甲醛固定石蜡包埋组织切片中以单细胞分辨率显示单个基因组位点的组蛋白修饰。我们表明，组蛋白H3（H3K4me2）的赖氨酸4在MYH11基因座上的二甲基化仅限于人类和小鼠组织切片中的平滑肌细胞（SMC）谱系，并且即使在没有检测到SMC标记基因表达的动脉粥样硬化病变中的表型调制的SMC中，该标记也持续存在。该方法有望在复杂多细胞组织发育和疾病的表观遗传机制研究中得到广泛应用。

PubMed免责声明

数字

**图1。ISH-PLA：检测组织切片中单个基因组位点组蛋白修饰的新方法**
(一)组合的示意图就地杂交（ISH）和近接连接试验（PLA）方法检测H3K4dime2011马来西亚令吉启动子。(b条)ISH-PLA程序的工作流程。(**c（c）**)人颈动脉5μm厚切片的ACTA2和DAPI免疫染色。确定了两个不同的层：中层（M）和外膜（A）。外膜内可见由ACTA2+SMC组成的小血管（箭头所示）。比例尺=100μm。(d日)外膜小动脉中的ISH-PLA(n个= 5). PLA放大（PLA+）被视为位于细胞核内的一个红点。*2011马来西亚令吉*H3K4dime PLA+信号仅限于ACTA2+内侧SMCs（箭头），CD31+内皮细胞（星形细胞）和外膜成纤维细胞（箭头）中不存在。（i–iii）：高倍放大，i）ACTA2，ii）PLA和iii）合并。比例尺=50μm。(**e（电子）**)在人颈动脉外膜血管切片中使用空载体探针进行ISH-PLA阴性对照。PLA扩增完全缺失表明生物素标记的杂交*2011马来西亚令吉*ISH-PLA放大需要探针。比例尺=50μm(如果)常规ChIP分析显示H3K4dime富集*2011马来西亚令吉*在SMC中，但不在EC中。平均值±标准差。；n个= 3; **P（P）*< 0.05. (克)SMC中的ISH-PLA(n个=3）和EC(n个= 3)*体外试验。2011马来西亚令吉*H3K4dime PLA扩增仅限于SMC。比例尺=10μm。

**图2。使用SMC谱系追踪小鼠模型验证ISH-PLA**
(一)SMC血统追踪是通过交叉进行的*我的11*-CreER公司^T2段ROSA26 STOPfloxeYFP转基因小鼠^+/+小鼠和用三苯氧胺治疗6至8周龄的小鼠，从而提供SMCswith eYFP的SMC特异性和永久性血统标记(n个=5).(b条)SMC-eYFP主动脉的免疫染色^+/+eYFP和ACTA2小鼠（下图）和未注射他莫昔芬（上图）。eYFP表达仅在他莫昔芬治疗后观察到，并且仅在中膜（M）内的SMC中观察到，与eYFP-染色阴性的内膜（I）和外膜（A）相比。五十：流明。比例尺=10μm。(**c（c）**)SMC-eYFP心脏组织切片中eYFP-表达的评估^+/+小鼠通过对eYFP（青色）、ACTA2（红色）和Dapi（蓝色）进行免疫染色。eYFP的表达严格限制于ACTA2+细胞。(d日)SMC-eYFP公司^−/−小鼠在心脏组织切片中ACTA2+细胞中完全缺乏eYFP表达。比例尺(**c–d码**)=100微米。**e、。**SMC-eYFP主动脉ISH-PLA结果^+/+老鼠展示了这一点*我的11*H3K4dime PLA阳性仅限于eYFP+内侧SMC（箭头）（介质：M）。不*我的11*在EC（恒星）中检测到H3K4dime PLA信号（内膜：I）。五十：流明。i–iii使用i）eYFP，ii）PLA和iii）合并，以更高的放大倍数显示eYFP+PLA+SMC。比例尺=10μm。**f、。**阴性对照，其中在SMC-eYFP中使用空生物素化载体进行ISH^+/+老鼠。不*我的11*鉴定出H3K4dime PLA+细胞。比例尺=10μm。

**图3。H3K4dime在*2011马来西亚令吉*SMC中的促进者就地人颈动脉的组织切片**
(一)人体颈动脉切片免疫染色，显示主要由ACTA2+SMC组成的介质（M），以及外膜（A）、内膜（I）和血管腔（*）(n个= 5). 比例尺=100μm。(b条)第个结果，共个*2011马来西亚令吉*H3K4dime PLA在DAPI（蓝色）和ACTA2（青色）人颈动脉切片中的表达。PLA信号（红色）仅在ACTA2+内侧SMC中观察到（箭头所示）。外膜内的ACTA2−细胞均未出现*2011马来西亚令吉*H3K4dime PLA+。比例尺=50μm。放大倍数更高b条i）DAPI（蓝色），ii）ACTA2（青色），iii）PLA（红色），iv）合并图像。(**c（c）**)阴性对照，先用空的生物素化载体进行ISH，然后用PLA进行生物素和H3K4dime抗体。比例尺=50μm。(d日)检测H3K27trime2011马来西亚令吉人颈动脉切片中的启动子。结果显示阳性*2011马来西亚令吉*CD31+EC中的H3K27trime PLA信号（箭头）。相反，ACTA2+细胞*2011马来西亚令吉*H3K27三聚PLA−。比例尺=50μm。i–iv）高倍图像：i）ACTA2（青色），ii）CD31（紫色），iii）PLA（红色），iv）合并，DAPI（蓝色）。(**e（电子）**)*2011马来西亚令吉*ACTA2（青色）染色人脑组织的H3K4dime PLA分析。脑血管中的SMC是*2011马来西亚令吉*H3K4dime PLA+（箭头）。比例尺=10μm。i–iv）DAPI（i）、ACTA2（ii）、PLA（iii）和合并图像（iv）脑组织内的小毛细血管。

**图4。H3K4dime上*2011马来西亚令吉*启动子在表型转换过程中持续存在体内在发生动脉粥样硬化的SMC谱系追踪小鼠中**
(一)在用载体（DMSO）或POVPC（10μg/mL，24h）处理的培养SMC中进行的ChIP分析显示，H3K4dime在*2011马来西亚令吉*.平均s.d。；n个= 3. (b条)mRNA定量*2011马来西亚令吉*显示POVPC引起的*2011马来西亚令吉*mRNA水平与载体相比。平均值±标准差；n个= 3; **P（P）*<0.01. (**c（c）**)SMC-eYFP中调制SMC的识别^+/+载脂蛋白E^−/−用西方饮食喂养18周的老鼠。用eYFP（青色）和MYH11（红色）对这些小鼠的腕头动脉（BCA）切片进行染色。eYFP+SMCs在它们共表达MYH11的培养基内和在它们失去MYH11表达的动脉粥样硬化病变内被鉴定。比例尺=100μm。(d日)SMC-eYFP的BCA部分^+/+载脂蛋白E^−/−小鼠用eYFP（青色）和ACTA2（黄色）染色，并分析MYH11 H3K4dime PLA。比例尺=100μm。(**e（电子）**). 框中区域1对应的图像(d日)Medial SMC是ACTA2+eYFP+和*我的11*H3K4一角PLA+（箭头）。eYFP（i）、PLA（ii）和Dapi（iii）合并图像的高倍放大。（f）对应于框中区域2的图像(d日). 在动脉粥样硬化病变中，eYFP+ACTA2−细胞的很大一部分是*我的11*H3K4dime PLA+表示SMC来源的细胞，根据内源性SMC标记物的检测无法识别（箭头）。比例尺(**e–f**)=10微米。eYFP（i）、PLA（ii）和Dapi（iii）合并图像的高倍放大。

**图5。ISH/PLA鉴定人冠状动脉粥样硬化病变中表型调制SMC的表观遗传调控**
(一)人类冠状动脉5μm厚切片的免疫染色显示，动脉粥样硬化病变内SM标记基因表达缺失：ACTA2（青色）、MYH11（红色）和Dapi（蓝色）。比例尺=100μm。(b条)免疫染色与*2011马来西亚令吉*H3K4dime ISH/PLA，带有ACTA2（青色）、PLA（红色）和Dapi（蓝色）。大部分ACTA2病变细胞对*2011马来西亚令吉*H3K4dime PLA（箭头），表明这些细胞来源于SMC。右侧面板放大倍率更高。比例尺=10μm。(**c（c）**)*2011马来西亚令吉*H3K27trime ISH-PLA在人类冠状动脉粥样硬化病变中的作用。Medial SMC严格遵守*2011马来西亚令吉*H3K27trime PLA–而病变SMC（白色箭头）和EC（黄色箭头）为*2011马来西亚令吉*H3K27三聚体PLA+。下部面板是中间面板的较高放大倍数。比例尺=50μm。(d日)总结表观遗传调控的卡通*2011马来西亚令吉*成熟SMC、表型调制SMC和非SMC中的启动子体内.

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中的注释

第三代方法揭示了细胞谱系祖先。
范伯格美联社。范伯格美联社。自然方法。2013年2月；10(2):117-8. doi:10.1038/nmeth.2338。自然方法。2013 PMID：23361091 免费PMC文章。

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