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.2013年1月12日14:3。
doi:10.1186/1471-212-14-3。

mTOR与Rheb-GTPase和猛禽的直接相互作用：使用荧光寿命成像进行亚细胞定位

拉胡尔·雅达夫 1, 皮埃尔·布尔戈斯, 安东尼·帕克, Valentina Iadevaia女士, 克里斯托弗·G·普劳德, 罗杰·阿艾伦, 詹姆斯·奥康奈尔, 安娜亚·杰什塔迪, 克里斯托弗·D·斯塔布斯, 斯坦利·W·博奇韦
附属公司

mTOR与Rheb-GTPase和猛禽的直接相互作用：使用荧光寿命成像进行亚细胞定位

拉胡尔·雅达夫等。 BMC细胞生物学. .

摘要

背景：哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）信号通路在细胞调节和多种疾病中起着关键作用。虽然人们认为Rheb GTPase调节mTOR，直接作用于mTOR的上游，而猛禽则直接作用于其下游，但在活细胞中的直接相互作用尚待验证，此外，据报道Rheb的定位仅限于细胞质细胞定位。

结果：在本研究中，利用绿色和红色荧光蛋白（GFP和DsRed）融合和活细胞的高灵敏度单光子计数荧光寿命成像显微镜（FLIM），显示了细胞质和重要的亚细胞核mTOR定位。使用荧光能量转移-FLIM测定标记有EGFP/DsRed的mTORC1组分Rheb、mTOR和raptor之间的相互作用。当与DsRed-Rheb共表达时，通过能量转移，EGFP-mTOR的激发态寿命约为2400 ps，在细胞质中减少到约2200 ps，而在细胞核中减少到2000 ps，对于共表达的EGFP-mTOR和DsRed-raptor也获得了类似的结果。mTOR的定位和分布通过氨基酸提取和再添加而改变，但雷帕霉素没有改变。

结论：结果表明，GFP技术结合FRET-FLIM成像在研究活细胞中信号成分的相互作用方面具有强大的威力，这为mTOR与Rheb以及mTOR和猛禽在活细胞中的直接物理相互作用提供了证据。

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数字

图1
图1
通过S6激酶活性确定EGFP-Rheb、EGFP-mTOR和DsRed-raptor的功能。在HEK细胞中表达EGFP-Rheb、EGFP-mTOR和DsRed-raptor，运行凝胶并用Rheb、mTOR、raptor和S6激酶（thr389）的相应抗体进行印迹。EGFP-Rheb的表达水平显示在A行第2、5和7道，但抗体无法检测到内源性水平。mTOR的内源性水平可以在B行、1、2、4和7道中看到（表达EGFP-mTOR时密度增加（3、5和6道，高MW太近，迁移差异太大）。猛禽的内源性水平可以在C行，泳道1、2、3和5中看到，泳道4、6和7显示DsRed猛禽的表达。
图2
图2
表皮生长因子-Rheb和DsRed-哺乳动物细胞中Rheb的表达。A类)HEK293电池和B类)HeLa细胞瞬时转染EGFP-Rheb（左面板）和DsRed-Rheb载体（右面板）。转染后24小时，在尼康TE2000 U共焦显微镜下分析活细胞。棒材8μm。
图3
图3
表达EGFP-Rheb的HEK293多光子诱导荧光的3D叠加图像。转染24小时后，通过多光子激发（920 nm激光激发，520 nm发射）从HEK293活细胞的TCSPC图像中获得荧光。未经进一步图像处理即显示原始数据。图像显示出清晰的Rheb核定位。黄色和红色方框（F）表示用于比较光子计数的核区和ER/Golgi区。图像尺寸120x100μm。
图4
图4
Rheb的免疫组织化学染色。用共焦显微镜观察表达EGFP-Rheb（左面板）的HEK293细胞或固定在4%甲醛中并用抗Rheb抗体与德克萨斯州红标记二级抗体结合处理的细胞。棒材10μm。
图5
图5
附属的-Rheb在ER上的细胞定位。A类)HEK293细胞；B类)用EGFP-Rheb瞬时转染HeLa细胞。转染细胞后24小时用1μM ER Tracker红染色，并用共焦显微镜分析活细胞。图像显示Rheb定位于ER Bar 8μm。
图6
图6
Rheb在高尔基体上的亚细胞定位。A）HEK293细胞；B）用EGFP-Rheb瞬时转染HeLa细胞。转染细胞后24小时用5μM BODIPY TR C5神经酰胺染色，并用共焦显微镜分析活细胞。图像显示Rheb定位于高尔基。棒材8μm。
图7
图7
EGFP-mTOR主要在哺乳动物细胞的细胞质中表达。研究了EGFP标记的mTOR在HEK293、HeLa和CHO细胞中的表达。用EGFP标记的mTOR瞬时转染细胞，并在转染48小时后使用Nikon TE2000U倒置显微镜和EC1共聚焦系统分析活细胞中的表达。（EGFP-mTOR；在mTOR和mTOR-EGFP的N端标记的EGFP；在mTO的C端标记的EGFP）。棒材8μm。
图8
图8
瞬时转染DsRed受体在不同哺乳动物细胞类型中的亚细胞定位。DsRed标记的猛禽在HEK293细胞中表达A）24小时和B）48小时，HeLa细胞48小时，C）和CHO细胞48h，D）用尼康TE2000 U共焦显微镜分析转染后不同时间的活细胞。棒材8μm。
图9
图9
HEK293细胞表达EGFP-mTOR的荧光寿命成像。A）转染48小时后HEK293细胞表达EGFP-mTOR的共聚焦图像；B）相同细胞的寿命图像（寿命的颜色编码如所示(C类))，图像尺寸120 x 110μm；C）图中所示的整个区域（白色边框）的寿命分布（B）寿命图像的数据采集时间最佳为3次30秒的累积，图像尺寸为128×128像素（蓝色十字线表示未使用的单像素寿命值）。荧光寿命值由（C），表示中显示的整个区域的值（B）从三个独立的实验中获得的数据为~2450±100ps。
图10
图10
DsRed Rheb在HEK293细胞中与EGFP mTOR直接相互作用，并且缺乏雷帕霉素的作用。（A、B）左面板：EGFP-mTOR共聚焦488 nm激发图像（与DsRed-Rheb共表达，转染48小时后）和DsRed/Rheb共聚焦543 nm激发图像，无（A）和（B）雷帕霉素（100 nM）处理24小时。（A、B）中间面板：共转染细胞的寿命图像（寿命的颜色编码显示在右侧面板中）。（A、B）右侧面板整个区域（白色边框）的寿命分布，如中间面板所示。中数据的生存期值（A）由于DsRed（连接到Rheb）的淬火作用，EGFP的右侧面板（连接到mTOR）从仅EGFP约2450±100 ps（见图9）减少到2200±100 psi（n=3），因此显示出直接相互作用。中的数据（B）右面板显示EGFP（附在mTOR上）的寿命，用雷帕霉素处理后，猝灭没有缓解，表明它不会影响直接相互作用。终身图像的数据采集时间最佳为3次30秒的累积，图像尺寸为128×128像素，bar 8μm。
图11
图11
EGFP-mTOR与HEK293细胞中的DsRed受体直接相互作用，雷帕霉素缺乏作用。（A、B）左面板：EGFP-mTOR的共聚焦488 nm激发图像（转染48小时后与DsRed受体共同表达）和DsRed-受体的543 nm激发图像，无（A）和（B）雷帕霉素（100 nM）处理24小时。（A、B）中间面板：共转染细胞的寿命图像（寿命的颜色编码显示在右侧面板中）。（A、B）右侧面板此处所取区域的寿命分布在细红线区域内（而不是如前所示的整个区域），如中间面板所示。中数据的生存期值（A）由于DsRed（附于猛禽）的淬灭，EGFP的右侧面板（附于mTOR）从约2450±100 ps（仅EGFP）（见图9）减少到2300±100ps（n=3），因此显示出直接相互作用。中的数据（B）用细红线标记的细胞的EGFP（附在mTOR上）寿命的右面板（下面的细胞被省略，因为它不表达DsRed受体，见左面板），用雷帕霉素治疗后，对寿命中心（2300 ps±100 ps）没有影响。终身图像的数据采集时间最佳为3次30秒的累积，图像尺寸为128×128像素，bar 8μm。
图12
图12
氨基酸饥饿和再刺激并不影响EGFP-mTOR和DsRed-Rheb在核周区的直接相互作用。(A-C公司)左面板：HEK293细胞的EGFP-mTOR共聚焦488 nm激发图像（转染48小时后与DsRed-Rheb共表达）和DsRed/Rheb共聚焦543 nm激发图像，HEK292细胞隔夜缺血，然后在D-PBS中缺氨基酸1小时(A类)然后再添加氨基酸（B、C）.去除氨基酸后出现点状结构，添加氨基酸后消失，且似乎不含Rheb。A类-C类)中间面板，共转染细胞的寿命图像（寿命的颜色编码显示在右侧面板中）。（A-C）右面板单元格区域（红线内）的寿命分布，如中间面板所示。A、 揭示二者都淬灭和未淬灭的EGFP反映了核周mTORheb和点状mTOR的混合物，如寿命图像所示；B）氨基酸再刺激10min后相同细胞；C）在氨基酸重新刺激60分钟后，点状结构消失。在所有时间点，以白色圆圈标记的区域，主要是ER/Galgi，显示淬火寿命，即Rheb与mTOR相互作用。棒材8μm。
图13
图13
氨基酸饥饿和再刺激对EGFP-mTOR与DsRed受体直接相互作用的影响。(A类-C类)左面板：HEK293细胞的EGFP-mTOR共聚焦488 nm激发图像（转染48小时后与DsRed受体共表达）和DsRed-受体共聚焦543 nm激发图像，HEK292细胞隔夜缺血，然后在D-PBS中缺氨基酸1小时(A类)然后再添加氨基酸(B类,C类). 去除氨基酸后出现点状结构，添加氨基酸后消失。(A类-C类)中面板，共转染细胞的终身图像。生存期的颜色编码显示在右侧面板中，这是EGFP-mTOR和DsRed受体共表达细胞区域的生存期分布（中间面板中用红线标记的区域）(A类-C类)右面板单元格区域（红线内）的寿命分布，如中间面板所示。A、 显示淬火EGFP，反映出mTOR/猛禽在点状结构和其他区域的直接相互作用。请注意，EGFP mTOR的寿命略有缩短，约为2350 ps，这可能表明在点状结构中可能仍存在一些mTOR-受体相互作用，但在氨基酸饥饿条件下“更松散”（比较图11）。（仅显示EGFP-mTOR表达的细胞用于比较，白色圆圈）。氨基酸再刺激后(B类,C类)点状结构消失，EGFP的淬火寿命恢复到<2300 PS。
图14
图14
Rheb的表达和转运到细胞核。不同细胞外信号对Rheb的激活使Rheb能够直接与mTOR相互作用。Rheb可能与mTOR结合，在细胞核和细胞质之间穿梭，也可能因未知功能而单独转移到细胞核（方案修改自[42]）。
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