Resveratrol improves cardiomyopathy in dystrophin-deficient mice through SIRT1 protein-mediated modulation of p300 protein

doi:10.1074/jbc.M112.392050

.2013年2月22日；288(8):5963-72.

doi:10.1074/jbc。M112.392050。 Epub 2013年1月6日。

白藜芦醇通过SIRT1蛋白介导的p300蛋白调节改善肌营养不良蛋白缺乏小鼠的心肌病

Atsushi Kuno公司¹, Yusuke S Hori公司, 细田良介, 马莎亚·塔诺, 三浦忠二, 岛本一木, Yoshiyuki Horio公司

附属公司

PMID： 23297412
PMCID公司： PMC3581415型
内政部： 10.1074/jbc。M112.392050型

白藜芦醇通过SIRT1蛋白介导的p300蛋白调节改善肌营养不良蛋白缺乏小鼠的心肌病

Atsushi Kuno公司等。生物化学杂志. 2013.

.2013年2月22日；288(8):5963-72.

doi:10.1074/jbc。M112.392050。 Epub 2013年1月6日。

作者

Atsushi Kuno公司¹, Yusuke S Hori公司, 细田良介, 马莎亚·塔诺, 三浦忠二, 岛本一木, Yoshiyuki Horio公司

附属

¹札幌医科大学医学院药理学系，札幌060-8556，日本。

PMID： 23297412
PMCID公司：下午3581415
内政部： 10.1074/jbc。M112.392050型

摘要

心肌病是Duchenne型肌营养不良的主要死亡原因。在此，我们表明，口服白藜芦醇可激活NAD（+）依赖性蛋白脱乙酰酶SIRT1，抑制肌营养不良蛋白缺乏mdx小鼠的心肌肥大和纤维化，并恢复心脏舒张功能。在mdx心脏中，促高营养性共激活物p300蛋白（而非p300 mRNA）上调，而白藜芦醇降低了p300蛋白水平。在培养的心肌细胞中，α（1）-激动剂苯肾上腺素诱导的心肌细胞肥大被SIRT1和白藜芦醇的过度表达所抑制，两者均下调p300蛋白水平，但不下调p300 mRNA水平。此外，SIRT1抑制p300对心钠素启动子的激活。我们发现SIRT1通过泛素蛋白酶体途径通过赖氨酸残基的脱乙酰化作用诱导p300下调。这些发现表明p300上调在营养不良心脏中的病理意义，并表明SIRT1激活对营养不良性心肌病具有治疗潜力。

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数字

**图1。**
**长期服用白藜芦醇抑制心肌肥厚和纤维化*中密度纤维板*老鼠。** A类，心脏重量(硬件)和心脏重量与体重的比值(*硬件/硬件*)控制C57BL/10(控制)，未经处理*中密度纤维板*老鼠(*中密度纤维板*)和白藜芦醇治疗*中密度纤维板*小鼠（RSV中密度纤维板).n个=5–6/组。B类采用定量RT-PCR检测左心室ANP。n个=5–6/组。*C、左侧面板*，用FITC-结合小麦胚芽凝集素染色的代表性横断面心脏显微照片。*比例尺*，10微米。*右侧面板*，通过计算每个心脏五个截面的400–800个测量值，确定每组4到5个心脏的平均最小费雷特直径。D类，小鼠典型超声心动图（M型图）。*IVST公司*室间隔厚度。D类和T型分别表示舒张期左心室后移的距离和时间间隔。E类，以距离/时间（mm/s）计算的舒张后壁速度的平均值。n个=5–6/组。*F、左侧面板*纤维连接蛋白的代表性免疫荧光图像(红色)心脏切片。*比例尺*，10微米。*右侧面板*每组中纤维粘连蛋白染色面积的百分比由每个心脏的8张图像确定。n个=4–5/组。*G公司*，心肌样品进行定量RT-PCR分析，以量化Col1a1、Col1a2、Col3a1和α-平滑肌肌动蛋白（α*座椅模块组件*).n个=每组5-6人。*H（H）*在赖氨酸9和14处的乙酰组蛋白H3的代表性免疫荧光图像（AcH3K9/K14，红色)和Hoechst33342染色(蓝色)在心里。*比例尺*，10微米。*一、左侧面板*心脏p300和SIRT1的免疫印迹分析。*右侧面板*定量心肌p300蛋白水平。n个=4-5/组。J定量RT-PCR测定心肌p300 mRNA水平。n个=5–6/组。*，第页< 0.05;*NS公司*，不显著。

**图2。**
**白藜芦醇抑制心肌细胞p300蛋白上调和肥大反应。** A类p300、SIRT1和α-微管蛋白（α-桶)用对照或p300靶向siRNA转染新生大鼠心肌细胞，然后用生理盐水或50μ米苯肾上腺素(*体育课*).B、左侧面板肌球蛋白重链染色新生大鼠心肌细胞的代表性区域(*MHC公司*)和Hoechst 33342。用生理盐水或PE处理转染对照或p300靶向siRNA的心肌细胞48小时。*比例尺*，50微米。*右侧面板*，量化细胞表面积。C类，HEK293细胞联合转染0.2μg心钠素(安普)启动子-luc、1 ng CMV-pRL和p300-HA，在不存在的情况下按指定剂量服用(*白色条*)或存在(*黑色条*)0.5 ng GATA4-FLAG。p300-HA和GAPDH的表达如*上部面板*根据萤火虫与海盘花荧光素酶活性的比值计算相对启动子活性。数据是三个独立实验的平均值。*D、左侧面板*p300、SIRT1和α-微管蛋白（α-桶)在用载体或PE处理的新生大鼠心肌细胞中，有或没有RSV（30μ米)预处理。*右侧面板*，根据GAPDH标准化p300蛋白水平的量化。E类，用载体或PE处理的新生大鼠心肌细胞中p300 mRNA水平的定量，有无RSV。n个=4/组。*F、左侧面板*用MHC和Hoechst 33342染色的新生大鼠心肌细胞的代表性区域。在没有或存在RSV的情况下，用载体或PE刺激心肌细胞。*比例尺*，10微米。*右侧面板*，细胞表面积定量。*G公司*新生大鼠心肌细胞ANP mRNA表达。n个= 3.H（H），染色质免疫沉淀(*炸薯条*)用载体对新生大鼠心肌细胞进行检测(控制)、PE或存在白藜芦醇的PE(*RSV+PE*)带有针对p300和兔IgG的抗体。输入占总染色质的1%。使用ANP基因和GAPDH基因启动子区域侧翼的引物扩增ChIP样品。实验重复了三次，获得了类似的结果。*，第页< 0.05;*NS公司*，不显著。

**图3。**
**白藜芦醇通过SIRT1降低p300蛋白水平。** *A、左侧面板*用免疫印迹法检测RSV处理12小时新生大鼠心室肌细胞p300的表达。*右侧面板*，通过四个独立实验进行量化。B类用免疫印迹法检测RSV处理的C2C12细胞中p300的表达。C类，RSV治疗的C2C12中p300 mRNA的定量(n个= 4).D、上部面板，用对照或SIRT1 siRNA转染的C2C12中p300和SIRT1的代表性免疫印迹，有或没有100μ米RSV治疗。*下部面板*β-肌动蛋白标准化p300蛋白的定量(n个= 4).E、左侧面板肌球蛋白重链染色新生大鼠心肌细胞的代表性区域(*MHC公司*)和Hoechst 33342。用对照或SIRT1 siRNA转染心肌细胞，并用PE（50μ米)在没有或存在RSV（30μ米).比例尺，50微米。*右侧面板*，细胞表面积定量。F类在转染FLAG-p300或对照载体的COS7细胞中进行免疫印迹分析，然后用载体或10 m米烟酰胺12h。*G公司*，来自对照SIRT1的心脏裂解物的代表性免疫印迹^{飞行/飞行}和SIRT1^{飞行/飞行}表达他莫昔芬诱导的小鼠*cre公司*重组酶给药他莫昔芬（SIRT1^{香港办事处}).正常开放和*闭合箭头*分别表示野生型和截断突变SIRT1。*，第页< 0.05;*NS公司*，不重要。

**图4。**
**SIRT1的过度表达下调p300蛋白并抑制心肌细胞肥大和ANP转录。** A类、FLAG-p300和野生型SIRT1-EGFP联合转染COS7细胞的免疫印迹分析(*SIRT1公司*(重量)*-EGFP公司*)，脱乙酰酶非活性H355Y突变株SIRT1-EGFP(*SIRT1公司*(*HY公司*)*-EGFP公司*)，或控制向量(*EGFP公司*).B类HEK293细胞与ANP启动子-luc和CMV-pRL共转染，在GATA4-FLAG缺乏（−）或存在（+）、p300-HA 0.2（+）或0.4μg（++）以及0.1μg野生型SIRT1的情况下。C类，转染HEK293细胞中ANP启动子活性B类，野生型除外(重量)或H355Y SIRT1(*HY公司*).D类，新生大鼠心肌细胞MHC染色的代表性区域(红色)和Hoechst 33342(蓝色). 用EGFP-N3转染心肌细胞(*EGFP公司*)SIRT1（WT）-EGFP或SIRT1。*比例尺*，20微米。E类，细胞表面积量化*左侧面板*，在三个独立实验中从100个随机EGFP表达细胞中测量。*，第页< 0.05;*NS公司*，不重要。

**图5。**
**p300的乙酰化状态调节其蛋白质水平。** A类p300乙酰化分析。用FLAG-p300转染COS7细胞，培养36 h，用载体处理10 m米烟酰胺或50 n米曲古抑菌素A作用12小时。用小鼠抗FLAG抗体或小鼠IgG免疫沉淀细胞裂解物。使用抗乙酰赖氨酸分析p300的乙酰化(*AcK公司*)抗体。*IP（IP）*，免疫沉淀。B类C2C12细胞内源性p300乙酰化分析。用3μ米用兔抗p300抗体或兔IgG免疫沉淀Ex527或载体12小时。使用抗乙酰赖氨酸抗体分析p300的乙酰化状态。C类，在用p300 FLAG和野生型SIRT1-EGFP共转染的COS7细胞中分析p300的乙酰化(重量)，突变型H355Y SIRT1-EGFP(*HY公司*)，或控制向量(*EGFP公司*). FLAG-p300乙酰化分析如下A类对输入样本进行免疫印迹以确认SIRT1-EGFP的表达。D类，代表性免疫印迹检测用FLAG-p300或p300-HA转染或与这两种结构共同转染的COS7细胞中的FLAG-tagged和HA-taged p300蛋白。E类、转染p300-HA、FLAG-PCAF或两者的COS7细胞中HA和FLAG的免疫印迹。F类在没有或存在SIRT1-EGFP的情况下，用p300-HA和/或FLAG-PCAF转染COS7细胞。细胞裂解物进行免疫印迹分析以测定p300-HA水平。为了评估p300 HAT活性，监测p53乙酰化。*G、左侧面板*，C2C12细胞中p300和GAPDH的代表性免疫印迹(安娜)持续12小时。*右侧面板*新生大鼠心室肌细胞p300和GAPDH的免疫印迹。新生大鼠心室肌细胞(*NRVM公司*)用指定剂量的阿那卡酸处理1小时，然后用50μ米PE持续24小时。*H、左侧面板*来自对照SIRT1的心脏p300乙酰化分析^{飞行/飞行}和心肌细胞特异性SIRT1敲除SIRT1^{香港办事处}老鼠。*右侧面板*、SIRT1免疫印迹和克重组酶。

**图6。**
**SIRT1对p300的去乙酰化促进泛素蛋白酶体依赖性p300的降解。** A类，与FLAG-p300和对照载体或野生型SIRT1联合转染的COS7细胞中FLAG-p100的免疫印迹分析(*SIRT1公司*(重量)-*EGFP公司*)在不存在或存在10μ米MG132。B类用10μ米MG132或车辆（不存在或存在100μ米白藜芦醇。C类在与FLAG-p300和SIRT1（WT）-EGFP、SIRT1(*EGFP公司*). 转染后36 h开始，用MG132处理细胞12 h。*AcK公司*，抗乙酰赖氨酸；*IP（IP）*，免疫沉淀。D类p300泛素化分析(优步). FLAG-p300和野生型SIRT1联合转染COS7细胞(*SIRT1-EGFP公司*)或EGFP-N3培养48小时。细胞与MG132培养12小时。用抗FLAG抗体免疫沉淀细胞裂解物，用抗泛素分析p300泛素化和乙酰化(优步)和抗乙酰赖氨酸(*AcK公司*)抗体。E类，人类p300蛋白图。据报道，含有泛素化潜在赖氨酸残基的结构域包含氨基酸964-1194。赖氨酸(*K（K）*)据报道，p300中的1020和1024为SIRT1脱乙酰目标。*KIX公司*CREB交互域；*布罗莫*，溴代多巴胺；帽子组蛋白乙酰转移酶。F类野生型共转染COS7细胞中FLAG-p300的免疫印迹分析(重量)、FLAG-p300或K1020R/K1024R(韩国)突变体FLAG-p300和对照载体(*EGFP-N3型*)或野生型SIRT1-EGFP。*G公司*，突变体p300泛素化的分析。如中所示D类分析与SIRT1-EGFP、HA-ubiquitin和野生型或KR突变型FLAG-p300共同转染的细胞中p300泛素化。

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1. McNally E.M.（2007）肌营养不良症心肌病治疗的新方法。每年。医学版58，75–88-公共医学
1. Backs J.，Olson E.N.（2006）通过组蛋白乙酰化/脱乙酰化控制心脏生长。循环。第98号决议，第15-24号-公共医学
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