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.2013年2月；16(2):183-92.
doi:10.1038/nn.3295。 Epub 2013年1月6日。

吗啡痛觉过敏通过小胶质细胞介导的神经元Clõ稳态破坏而门控

弗朗西斯科·费里尼 1, 团庄, Theresa-Alexandra M Mattioli公司, 索菲·拉夫雷, 托马斯·德尔·吉迪奇, 路易斯·伊蒂安·洛伦佐, 安妮·卡斯通圭, 尼古拉斯·多扬, 张文波, 安托万·戈丁, 丹妮拉·莫尔, 西蒙·贝格斯, 凯伦·凡达尔, 让·马丁·博利厄, 凯瑟琳·卡希尔, 迈克尔·索尔特, 伊夫·德·科宁克
附属公司

小胶质细胞介导的神经元Cl⁻稳态破坏对吗啡痛觉过敏的调控

弗朗西斯科·费里尼等。 自然神经科学. 2013年2月.

摘要

治疗疼痛的一个主要悬而未决的问题是黄金标准止痛药吗啡和其他鸦片制剂产生的反常痛觉过敏。我们发现，吗啡诱发痛觉过敏的治疗导致K（+）-Cl（-）共转运体KCC2下调，损害了大鼠脊髓板神经元的Cl（-）稳态。恢复阴离子平衡电位可以逆转吗啡诱导的痛觉过敏，而不会影响耐受性。通过切除脊髓小胶质细胞也可以逆转痛觉过敏。吗啡痛觉过敏（而非耐受）需要小胶质细胞中P2X4受体（P2X4R）的μ阿片受体依赖性表达和P2X4Rs对脑源性神经营养因子（BDNF）释放的μ非依赖性门控。阻断BDNF-TrkB信号维持Cl（-）稳态并逆转痛觉过敏。从小胶质细胞中删除Bdnf的基因靶向小鼠不会对吗啡产生痛觉过敏。然而，这些小鼠的吗啡镇痛和耐受性均未受到影响。我们的发现将吗啡诱导的痛觉过敏与耐受性分离开来，并建议将小胶质细胞到神经元P2X4-BDNF-KCC2通路作为在不影响吗啡镇痛的情况下预防痛觉过敏的治疗靶点。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。反复使用吗啡会导致痛觉过敏和耐受
a–c.通过Hargreaves足底试验和von Frey丝评估大鼠吗啡耐受性和痛觉超敏反应的时间进程：a。吗啡后1小时的热痛阈（第3-7天与第1天，χ2: 61.5;#P（P）<0.001）或盐水注射（吗啡与第1-4天生理盐水*P（P）< 0.05; ***P（P）< 0.001);b.吗啡前的热痛阈（5-7天与第1天，χ2: 20.7;#P（P）<0.001）和盐水注射（吗啡与第4-7天生理盐水*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01);c（c）吗啡或生理盐水注射前的机械疼痛阈值。第7天，吗啡治疗大鼠的阈值(n个=7）与第1天相比显著减少（χ2: 13.58,#P（P）<0.01）和生理盐水组(n个= 6; **P（P）< 0.01).d–e日与盐处理的对照组相比，吗啡处理的大鼠的伤害行为逐渐增加：d日.皮下注射期间（第5-9天）发声大鼠的百分比与第1天*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01);e（电子）.热刺激后的舔舔时间（第0天，P（P）> 0.05; 第7天，U:7*P（P）< 0.05).如果在上午注射之前通过旋转棒评估盐水或吗啡注射的第0天和第7天的最大运行速度（U:21，P（P）> 0.05). 所有阈值均归一化为基线。缩写：PWT=爪退出阈值；CTR=盐水对照；MS=硫酸吗啡；RPM=每分钟转数；误差线=s.e.m。
图2
图2。吗啡破坏氯离子−L内稳态我神经元
a–bCl减少−挤压能力（L）我之后的神经元体内大鼠吗啡治疗：a。在Cl存在下，盐水或吗啡处理后30ms吞咽GABA的反应−负载（29 mM）。在灰色，在−55.5 mV下获得的响应。bGABA的I-V关系A类吗啡治疗大鼠的电流(n个=6个单元格）与对照组相比右移(n个=5个单元格）；虚线指示Cl时的I–V关系−KCC2拮抗剂速尿阻断了挤压能力。c（c）.体外吗啡的作用（1μM，>3 h；n个=7个细胞）关于GABA的I–V关系A类电流与盐水控制(n个=6个单元格）。d日.池EGABA公司神经元的数量b（U:2）和c（c）（U:6*P（P）< 0.05).e–f.Cl公司−重复抑制输入下的积累。e（电子）.来自控制的代表性记录道（平均重复10次）-黑色-和体外吗啡处理的L我神经元-灰色-夹持电压为−90 mV(上部面板); 在图表中(下部面板)，重复刺激期间eIPSC振幅降低的速率（20 Hz）。振幅值标准化为第一个eISPC。未观察到差异（CTR：n个= 6; 微软：n个=4个单元格；F： 0.8，P（P）> 0.05).如果.实验e（电子）以0 mV重复。注意吗啡处理神经元中的eIPSC抑制更大更快。吗啡和对照组之间的差异显著（CTR：n个= 6; 微软：n个=4个单元格；F： 21.98*P（P）< 0.05).克Gramicidin穿孔膜片钳记录对照组在−60 mV下获得的GABA反应——红色虚线-和吗啡治疗的L我之前的神经元(黑色)ACTZ（50μM；灰色; 记录道按峰值振幅缩放；箭头表示GABA喘息）。注意吗啡神经元的双相反应和ACTZ后的单相反应。下图，脉冲后1s测得的I-V曲线(黑色箭头). 注意增加的EGABA公司乙酰唑胺治疗前后的差异。小时鞘内注射ACTZ（22.5μg，从第7天到第9天）对吗啡诱导的机械（生理盐水，n个= 5; ACTZ中，n个= 5; U： 0**P（P）<0.01）和热（盐水，n个= 11; ACTZ公司，n个= 9; U： 15.5*P（P）<0.05）大鼠痛觉过敏。所有阈值均归一化为基线。虚线是基线阈值。缩写：PWT=爪退出阈值；CTR=对照；MS=硫酸吗啡；ACTZ=乙酰唑胺；误差线=s.e.m。
图3
图3。吗啡对KCC2活性和表达的影响
a。大鼠肺组织KCC2免疫染色我和L二7天后注射生理盐水或吗啡（标尺，50μm）。b。Western blot显示生理盐水和吗啡处理大鼠背角和腹角KCC2的总表达。直方图显示，KCC2表达的量化标准化为背部肌动蛋白水平（单尾t检验，t:2.1*P（P）<0.05）和腹角（单尾t检验，P（P）> 0.05).c（c）在不使用β-巯基乙醇的情况下进行Western blot以保存KCC2齐聚。直方图显示了背侧KCC2寡核苷酸/单体比率的量化（单尾t检验，t:2.1*P（P）<0.05）和腹角（单尾t检验，t:0.6，P（P）> 0.05).d–e。负载氯离子的大鼠脊髓切片氯离子成像−-敏感染料MQAE。d日.伪彩色图像显示控件L的寿命映射我神经元存在2.5或15 mM KCl。L的寿命我控制条件下的神经元（3.44±0.34 ns，n个=11个细胞）在暴露于高细胞外KCl以逆转KCC2转运（3.02±0.24 ns，n个=11；P（P）< 0.001).e（电子）.对照组荧光强度的代表性痕迹(黑色)和吗啡处理的神经元(灰色)显示细胞内Cl的比率−累积（%ΔF/F0)在15 mM KCl存在下。15 mM KCl溶液之前的稳态寿命测量值没有差异（对照组为3.37±0.06和3.23±0.06 ns与吗啡；对应于7.0±0.7和8.6±0.8 mM的Cl−在控制中与吗啡；U： 38，P（P）> 0.05). 缩写：CTR=盐水对照；MS=硫酸吗啡；误差线=s.e.m。
图4
图4。吗啡诱导的痛觉过敏依赖于小胶质细胞的激活
一.CD11b在大鼠SDH中的表达在经过5天的盐水或吗啡治疗（标尺，30μm）和荧光强度定量（CTR:0.84±0.06 i.u。，n个=28节；MS：2.78±0.22 i.u。，n个=34个截面；U： 8、，P（P）< 0.001).b–d。鞘内注射抗mac1糖蛋白结合抗体的效果(与单用皂苷）对SDH CD11b表达、吗啡诱导的痛觉过敏和耐受性（吗啡治疗第7天至第9天进行鞘内注射）：b用抗mac1抗体（标尺50μm）去除小胶质细胞后，SDH中CD11b的表达（sap:10.12±1.32 i.u。，n个=17节；mac-1-sap:7.84±2.23 i.u。，n个=16节；U： 55岁**P（P）< 0.01);c。吗啡注射前的热痛阈（mac1-saporin与第9天单用皂苷，U:1**对<0.01);d。注射吗啡后1h的热痛阈（第9天，U:12，P（P）>0.05）。图中的所有阈值均标准化为基线。缩写：PWT=爪退出阈值；CTR=对照；MS=硫酸吗啡；sap=皂苷；mac1-sap=皂苷结合抗mac1抗体；误差线=s.e.m。
图5
图5。吗啡诱导的痛觉过敏需要小胶质细胞中的P2X4R
a。鞘内注射用吗啡（100 nM，n个= 7; H： 19.98**P（P）<0.01），吗啡+TNP-ATP(n个= 5, *P（P）>0.05），吗啡+PPADS(n个= 8; **P（P）< 0.01),与CTR公司(n个=7）。b–d段.缺乏痛觉过敏第2rx4页−/−老鼠：b。热能(n个=每组5只小鼠）和机械(n个=每组7只小鼠）皮下注射吗啡5天后的痛阈第2rx4页+/+小鼠vs第2rx4页−/−小鼠（机械试验用U:5，热试验用U:2*P（P）< 0.05).c（c）机械刺激爪子后的舔舐时间（吗啡治疗第2rx4页+/+与吗啡治疗第2rx4页−/−*P（P）< 0.05; # 与基线相比存在显著差异）；d日.皮下注射产生的发声（吗啡处理第2rx4页+/+与其他组*P（P）< 0.05; # 与基线相比存在显著差异）。e–g鞘内注射TNP-ATP（30 nmol）对大鼠MIH的影响：e（电子）.车内注射吗啡前的热痛阈(n个=8）与注射TNP-ATP的大鼠(n个= 8; 第7天，U:13*P（P）< 0.05);如果吗啡后1h的热痛阈。克吗啡注射前测量吗啡治疗大鼠TNP-ATP后的机械戒断阈值（第7天，CTR，n个=6，TNP-ATP，n个= 7; U： 0**P（P）<0.01).小时。X-gal染色第2rx4页−/−小鼠（比例尺，30μm）。对照组SDH染色面积百分比（3.6±0.3%，n个=5节）和吗啡处理小鼠（4.8±0.3%，n个=12节；U： 10、*P（P）< 0.05).i–j。吗啡处理（100 nM）小胶质细胞培养物中P2X4R的表达和功能增加：我吗啡治疗后P2X4R的表达与生理盐水对照组标准化1天（d1，n个=7次试验），3天（d3，n个=7）和5天（d5，n个= 7; H： 19.35中***P（P）< 0.001);j个吗啡处理的小胶质细胞在5天内ATP介导的电流（峰值电流标准化为ATP前基线：1.6±0.2；n个=12个细胞；U： 91*P（P）< 0.05)与控制（1.0±0.1；n个=28个单元格）。图中的所有阈值均标准化为基线。缩写：PWT=爪退出阈值；CTR=对照；MS=硫酸吗啡；a.u.=任意单位；X-gal=5-溴-4-氯吲哚基吡喃半乳糖苷；误差线=s.e.m。
图6
图6。更改的Cl−脊髓神经元的稳态和吗啡诱导的痛觉过敏依赖于P2X4R-BDNF-TrkB信号
一基于ELISA的100 nM吗啡处理的培养小胶质细胞BDNF释放的测量(n个=14个试验，H:30.17***P（P）<0.001），吗啡+TNP-ATP(n个＝5，P（P）>0.05），吗啡+PPADS(n个= 5, ***P（P）<0.001），吗啡+安替比林(n个= 5;P（P）> 0.05)与盐水(n个= 14).b.鞘内注射吗啡处理的小胶质细胞5小时后的大鼠机械戒断阈值(n个= 7; H： 23.66**P（P）<0.01），吗啡+TrkB-Fc(n个= 7;P（P）>0.05），吗啡+IgG-Fc(n个=7**P（P）< 0.01),与CTR公司(n个=7）。c–d码抗TrkB抗体（1μg/ml）对吗啡诱导的E位移的影响GABA公司单位：L我神经元在体外:c（c）GABA的I–V关系A类吗啡孵育后电流(n个=12个细胞），吗啡+抗TrkB(n个=7）或处于控制中(n个=6）和，d日，各自的EGABA公司值（H:11.16*P（P）< 0.05).e–f.通过Hargreaves足底试验，鞘内注射ACTZ和抗TrkB对吗啡诱导的疼痛超敏反应和耐受性的影响：e、。ACTZ-（22.5μg，n个=9），抗TrkB-（30μg，n个=7）和车辆注射大鼠(n个= 11; 第9天*P（P）< 0.05;箭头指示注射）；如果ACTZ、抗TrkB和车辆注射组（ACTZ）在吗啡作用1小时后的热痛阈与对照组在第8-9天*P（P）< 0.05;箭头指示注射）。所有阈值均归一化为基线。缩写：PWT=爪退出阈值；CTR=对照；MS=硫酸吗啡；Anti-TrkB=抗TrkB阻断抗体；ACTZ=乙酰唑胺；误差线=s.e.m。
图7
图7。小胶质细胞BDNF基因缺失可消除吗啡诱导的痛觉过敏，但不能抑制耐受性
a–c：评估CD11b-Cre中吗啡诱导的痛觉过敏+/LoxBDNF小鼠(n个=7）与LoxBDNF小鼠(n个= 7):一吗啡5天对机械阈值的影响（F:3.499*P（P）< 0.05);b.机械刺激后的舔食时间（H:16.21**P（P）< 0.05);c（c）和皮下注射产生的发声。d日——e（电子）：CD11b-Cre中吗啡镇痛作用的评估+/LoxBDNF小鼠(n个= 7; *P（P）<0.05）vs LoxBDNF小鼠(n个= 7):d。吗啡幼年小鼠对单剂量吗啡镇痛反应的时间进程；e、。CD11b-Cre注射吗啡或生理盐水5天后的吗啡剂量反应曲线+/LoxBDNF小鼠(n个=7）与LoxBDNF小鼠(n个= 7). 吗啡治疗动物的向右移位表明CD11b-Cre和CD11b-Cre中吗啡耐受性的发展+/LoxBDNF和LoxBDNF小鼠，两种基因型之间没有显著差异。盐水注射对照组的ED50为：LoxBDNF小鼠3.5±0.3 mg/Kg，CD11b-Cre+/LoxBDNF 3.3±0.3毫克/千克(P（P）> 0.05); 吗啡处理小鼠的ED50为：LoxBDNF 16.5±1.0 mg/Kg和CD11b-Cre+/LoxBDNF 14.3±1.1毫克/千克(P（P）> 0.05).如果CD11b Cre患者纳洛酮诱发戒断综合征+/LoxBDNF小鼠（CTR，n个= 3; 理学硕士，n个=6）与LoxBDNF小鼠（CTR，n个= 5; 理学硕士，n个= 5). 与生理盐水对照组相比，两个吗啡治疗组的戒断累积评分显著升高，但CD11b-Cre之间没有差异+/LoxBDNF和LoxBDNF小鼠。所有阈值均归一化为基线。缩写：PWT=爪退出阈值；CTR=对照；MS=硫酸吗啡；误差线=s.e.m。
图8
图8。吗啡诱导的痛觉过敏需要激活两条独立的信号通路
a–c鞘内注射低剂量（+）NL（5 ng）对吗啡诱导的疼痛超敏反应、耐受性和小胶质细胞活化的影响：a。（+）NL或溶媒治疗大鼠（+）NI注射吗啡或生理盐水前的热戒断阈值，n个= 8; 吗啡+（+）NL，n个= 7; 吗啡，n个= 8; *P（P）< 0.05);b治疗1小时后的热痛阈。c。鞘内注射吗啡或吗啡+（+）NL（标尺，30μm）5天后大鼠SDH中CD11b免疫染色和定量（CTR：n个=28节；微软：n个=34节；吗啡+（+）NL:n个=34节***P（P）< 0.001).d日.L型我E类GABA公司3小时后在体外仅使用（−）NL(n个=6个单元格）与吗啡+（−）NL(n个= 6; U： 14人；P（P）>0.05）和（+）NL(n个= 6)与吗啡+（+）NL(n个=8，U:26；P（P）> 0.05).e、。鞘内注射吗啡+（−）NL处理的小胶质细胞培养物5 h后的机械戒断阈值(n个= 8; H： 12.97*P（P）<0.05），吗啡+（+）NL(n个= 5; *P（P）< 0.05)与单用吗啡(n个= 7).f、。吗啡（100 nM，n个=10次试验，H:26.49***P（P）<0.001），吗啡+（−）NL(P（P）>0.05），吗啡+（+）NL(n个＝5***P（P）<0.001），（−）荷兰(n个＝3，P（P）>0.05），（+）荷兰(n个= 6,P（P）>0.05）与盐水(n个= 10).g、。ATP诱发细胞内[Ca升高2+]用吗啡（100 nM，n个=54个细胞，H:67.98***P（P）<0.001），吗啡+（−）NL(n个= 38,P（P）>0.05），吗啡+（+）NL(n个= 40,***P（P）<0.001），（−）荷兰(n个= 15,P（P）>0.05），（+）荷兰(n个= 15,P（P）>0.05），或盐水(n个= 35).小时。鞘内生理盐水、吗啡、吗啡+（−）NL、吗啡+（+）NL治疗5天的大鼠脊髓P2X4R蛋白的Western blot。i、。基于ELISA的吗啡+（−）NL处理小胶质细胞BDNF释放的测定(n个=5次试验，H:14.29***P（P）<0.001），吗啡+（+）NL(n个＝5***P（P）< 0.001),与吗啡(n个= 14).j。基于ELISA的吗啡处理小胶质细胞BDNF释放的测定(n个=4次试验，H:15.84***P（P）<0.001），吗啡+LPS-RS 1 ng/ml(n个= 4,***P（P）<0.001），吗啡+LPS-RS 10 ng/ml(n个= 4,***P（P）<0.001），吗啡+LPS-RS 100 ng/ml(n个= 4,***P（P）<0.001），LPS-RS 100 ng/ml(n个= 4,***P（P）<0.001）与控制(n个= 4).k个吗啡（剂量从10 mg/kg增加到40 mg/kg，每天两次腹腔注射，持续7天）对TLR4缺陷C3H/HeJ小鼠机械敏感性的影响(n个= 11)与野生型C3H/HeOuJ(n个= 8). 机械敏感性指数计算为（10-PWs）/PWs（10=用3.41 g校准灯丝刺激；PWs=爪子抽出）。小鼠组间机械性痛觉超敏反应的发展无差异（U:30；P（P）> 0.05). 图中的所有阈值均标准化为基线。缩写：PWT=爪退出阈值；CTR=对照；MS=硫酸吗啡；（-）NL=（-）-纳洛酮；（+）NL=（+）-纳洛酮；LPS-RS=球形红杆菌的脂多糖；i.u.：强度单位；误差线=s.e.m。
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中的注释

  • 疼痛：小胶质细胞控制慢性疼痛。
    刘易斯·S。 刘易斯·S。 Nat Rev神经科学。2013年3月；14(3):154. doi:10.1038/nrn3442。Epub 2013年1月23日。 Nat Rev神经科学。2013 PMID：23340603 没有可用的摘要。

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