Krüppel-like factor KLF8 plays a critical role in adipocyte differentiation

doi:10.1371/journal.pone.0052474

.2012;7（12）：e52474。

doi:10.1371/journal.pone.0052474。 Epub 2012年12月21日。

KLüppel-like factor KLF8在脂肪细胞分化中起关键作用

哈米·李¹, Hyo Jung Kim（金孝中）, Yoo Jeong Lee先生, 李敏英, Choi贤进, Hyemin Lee（李慧敏）, 金在宇

附属公司

PMID： 23285057
预防性维修识别码：项目经理3528641
内政部： 10.1371/日记本.0052474

KLüppel-like factor KLF8在脂肪细胞分化中起关键作用

哈米·李等。公共科学图书馆一号. 2012.

.2012;7（12）：e52474。

doi:10.1371/journal.pone.0052474。 Epub 2012年12月21日。

作者

哈米·李¹, Hyo Jung Kim（金孝中）, Yoo Jeong Lee先生, 李敏英, Choi贤进, Hyemin Lee（李慧敏）, 金在宇

附属

¹韩国首尔延世大学医学院遗传科学研究所代谢调控综合基因组研究中心生物化学和分子生物学系。

PMID： 23285057
预防性维修识别码：项目经理3528641
内政部： 10.1371/日记本.0052474

摘要

KLF8（Krüppel-like factor 8）是一种锌指转录因子，已知在细胞周期、凋亡和分化的调节中发挥重要作用。然而，它在脂肪生成中的生理作用和功能尚不清楚。在本研究中，我们发现KLF8是控制脂肪细胞分化的关键调节因子。在3T3-L1前脂肪细胞中，我们发现KLF8表达在分化过程中受到诱导，随后表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）。通过添加针对KLF8的siRNA，脂肪细胞分化显著减弱，而KLF8过度表达导致分化增强。此外，荧光素酶报告子分析表明，KLF8过表达诱导PPARγ2和C/EBPα启动子活性，表明KLF8是PPARγ和C/EBα的上游调控因子。通过位点突变分析，KLF8结合位点分别定位于C/EBPα启动子的-191区和PPARγ启动子的-303区。综上所述，这些数据表明KLF8是转录因子网络的关键组成部分，在脂肪生成过程中控制最终分化。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。KLF8在3T3-L1脂肪细胞分化和小鼠脂肪组织中的表达。**
（A）在诱导分化前后的指定时间从3T3-L1细胞中提取总RNA。通过RT-PCR测定KLF5、KLF8、KLF12和KLF17的表达水平。（B）生成抗兔多克隆KLF8抗体，并在转染pcDNA3.0或pcDNA3.0-KLF8-FLAG的293T细胞上进行测试。使用抗KLF8或抗FLAG对全细胞裂解物进行免疫印迹（IB），以验证特异性抗原-抗体相互作用。（C）在3T3-L1细胞分化期间的指定时间点进行KLF8表达的Western blot分析。（D）采用实时定量PCR检测小鼠附睾脂肪组织基质血管分数（SVF）或脂肪分数中的KLF5、KLF8和脂肪酸合成酶（FASN）mRNA水平。数据表示平均值±SD。

**图2。KLF8敲除阻断3T3-L1脂肪细胞分化。**
使用脂蛋白内酰胺RNAi/MAX试剂，用KLF8 siRNA在约70%的汇合处处理前脂肪细胞3T3-L1细胞。24小时后，将细胞进行胰蛋白酶消化，并以融合的细胞密度进行复制。额外24小时后，诱导细胞分化。（A）诱导后20小时，制备细胞提取物，并通过实时RT-PCR分析对KLF8表达的影响。（B）第8天油红-O染色。低面板表示来自3个独立实验的分光光度染色计数。（C）在指定时间采集细胞，用SDS-PAGE分离细胞裂解产物，并用C/EBPβ、PPARγ和C/EBPα抗体进行免疫印迹。显示了LAP、肝激活蛋白、LIP、肝抑制蛋白、PPARγ1、PPARβ2以及C/EBPα蛋白的43或30 kDa。（D）为了研究siRNA对有丝分裂克隆扩增的影响，在诱导后第0天或第2天测定细胞数量。与D0中的细胞数相比，折叠增加了。（A）、（B）和（D）中的数据表示平均值±标准差***P（P）*<0.01.

**图3。KLF8的过度表达导致分化增强。**
使用pcDNA3.0-KLF8-FLAG或空载体通过电穿孔瞬时转染前脂肪细胞3T3-L1细胞，并按照材料和方法中所述的标准激素混合物进行分化。（A）分化5天后，通过油红-O染色检测脂质积聚。（B）分化过程中在指定时间制备的全细胞提取物的Western blot分析。显示了LAP、肝激活蛋白、LIP、肝抑制蛋白、PPARγ1、PPARβ2以及C/EBPα蛋白的43或30 kDa。

**图4。KLF8调节C/EBPα和PPARγ2启动子诱导转录。**
（A）本研究使用了一系列克隆到pGL3-Basic载体的C/EBPα启动子结构。用脂质体转染荧光素酶构建物转染NIH3T3细胞，2天后测定荧光素素酶活性。共转染质粒pcDNA3.0、pCMV-C/EBPβ或pCMV-KLF8-FLAG。（B）类似地，PPARγ2启动子（从转录起始位点计数的−350）通过荧光素酶分析进行了研究。（C）对C/EBPα启动子进行突变分析。−205结构用于定点突变，以便在−191和−178区域之间引入KLF和/或C/EBP调节元件。KLF8结合位点用蓝色表示，而C/EBP位点用红色标记。突变区域用下划线表示。将这些构建物与KLF8和/或C/EBPβ过表达质粒一起转染NIH3T3细胞。（D）对PPARγ2启动子进行突变分析。通过定点突变对KLF位点进行突变，并通过荧光素酶分析对得到的构建物进行分析。数据表示平均值±SD***P（P）*<0.01.

**图5。KLF8直接与C/EBPα和PPARγ2启动子结合。**
（A） EMSA实验使用β-珠蛋白（阳性对照）、C/EBPα或PPARγ2启动子的KLF结合位点作为探针。使用TNT T7快速主混合物在体外翻译FLAG标记的KLF8蛋白。（B） EMSA实验使用C/EBPα启动子的野生型或突变探针。FLAG标记的C/EBPβ-LAP或KLF8蛋白使用TNT T7快速混合液进行体外翻译。（C）体外翻译蛋白的Western blot分析。n.s，非特定。（D）在诱导分化后的指定时间点，使用对照IgG、抗C/EBPβ或抗KLF8抗体对3T3-L1细胞染色质进行ChIP。免疫沉淀DNA作为PCR模板检测PPARγ或C/EBPα启动子区。

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[1] Kopelman PG（2000）肥胖是一个医学问题。自然404:635-643。-公共医学

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