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.2012;7（12）：e51878。
doi:10.1371/journal.pone.0051878。 Epub 2012年12月13日。

大鼠胰腺中的星形细胞是干细胞，可以促进肝脏再生

克劳斯·科尔德斯 1, 艾丽斯·萨维察, 希尔克·戈泽, 迪特尔·哈辛格
附属公司

大鼠胰腺中的星形细胞是干细胞，可以促进肝脏再生

克劳斯·科尔德斯等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

胰腺干/祖细胞的身份仍在讨论中。他们被认为来源于胰腺导管上皮和/或胰岛。在这里，我们报告了被认为有助于胰腺纤维化的大鼠胰腺星状细胞（PSC）具有干细胞特征。PSC位于胰岛和腺泡之间，显示出类似于脐血干细胞和间充质干细胞的基因表达模式。细胞因子处理分离的PSC可诱导典型肝细胞标记物的表达。PSC衍生的类肝细胞表达内胚层蛋白，如胆盐输出泵和中胚层蛋白波形蛋白。在存在2-乙酰氨基芴的情况下，将增强型绿色荧光蛋白表达大鼠培养激活的PSC移植到部分肝切除后的野生型大鼠中，结果表明，PSC能够通过分化为肝细胞和胆管细胞，重建宿主肝脏的大面积。性别不匹配的雄性PSC移植到雌性大鼠体内后，Y染色体荧光原位杂交证实了移植PSC的这种发育命运。移植的PSC显示出长期存活，而肌肉成纤维细胞无法融入宿主肝脏。克隆扩增PSC的移植进一步验证了PSC的分化潜能。PSC克隆保持了星状细胞和干细胞标记的表达，并保持了它们的分化潜能，这表明PSC具有自我更新的潜力。这些发现表明，PSC具有干细胞特征，可以通过跨组织边界的分化促进受损器官的再生。

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数字

图1
图1。培养PSC、UCBSC和肌肉成纤维细胞中的星形细胞标记物。
(A、 D、G、J)新鲜分离的PSC培养1天(B、 E、H、K)克隆扩张UCBSC和(C、 F、I、L)用相差显微镜和星状细胞标记物抗体分析大鼠肌肉成纤维细胞(D、 E、F)α-SMA(G、 H、I)结蛋白和(J、 K，L)GFAP（红色）。从α-SMA、结蛋白和GFAP的表达来看，分离的PSC是典型的星状细胞。星状细胞标记物α-SMA和GFAP仅在UCBSC克隆中弱表达，而结蛋白在蛋白水平上仍无法检测到。细胞核用DAPI（蓝色）染色。
图2
图2。PSC含有视黄基棕榈酸酯并表达巢蛋白。
(A类)HPLC分析显示，新分离的大鼠PSC的裂解液中含有棕榈酸视黄酯（红色箭头）。(B类)在培养的第二天，分离的PSC被巢蛋白抗体（红色）阳性标记。(C类)巢蛋白表达细胞主要见于大鼠胰岛（红色）。胰岛素（绿色）的免疫荧光染色用于验证巢蛋白的存在+胰岛细胞（红色）。(D类)在胰岛（绿色）中观察到具有分支细胞突起的Desmin表达细胞。(E类)巢穴+胰岛细胞（红色）的星状细胞标记结蛋白（绿色）也呈阳性，通过共聚焦激光扫描显微镜对蛋白质的联合染色和连续显微图像的三维（3D）渲染进行了记录。巢蛋白和结蛋白的共同定位以白色突出显示，表明胰岛中存在PSC。(F类)免疫荧光染色仅在少数腺泡周细胞中检测到巢蛋白(G公司)而大鼠胰腺导管细胞巢蛋白阴性（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）标记。
图3
图3。PSC中星状细胞和干细胞相关因子的定量mRNA分析。
用qPCR方法研究了星形细胞标记物α-SMA、GFAP、结蛋白和联会蛋白以及干/祖细胞相关蛋白CD133、SOX9、GDF3和slain1在一天培养的PSC、PSC克隆和UCBSC克隆中的表达。PSC表达的干细胞相关因子水平与UCBSC克隆相当或更高。使用三到五个独立的PSC原代培养物进行qPCR分析。对PSC克隆和UCBSC克隆进行了三次测量。显示了显著差异和平均值（±SEM）的标准误差[*P<0.05%]。
图4
图4。用Western blot分析PSC中的干/祖细胞相关因子。
分析CD133在PSC和UCBSC细胞膜组分中的表达。三种不同细胞分离物的PSC培养7天（7d），取三种不同克隆的UCBSC进行免疫印迹。为了指示细胞膜蛋白组分，膜联蛋白II作为对照。notch1受体主要在培养1天（1d）的新鲜分离的PSC中检测到，在培养激活的PSC（7d）和UCBSC中也有少量检测到。通过核蛋白组分的Western blot研究，PSC和UCBSC中β-catenin的核定位表明β-catentin-dependet Wnt信号传导活跃。与此一致，Wnt靶基因PITX2在两种细胞类型中也检测到。在PSC和UCBSC中检测到干/祖细胞相关的numb1/3亚型，而在这两种细胞类型中均未检测到numb2/4亚型。在整个肝脏的裂解液中发现Numb2/4亚型。
图5
图5。免疫荧光法分析PSC中干/祖细胞相关因子。
(A、 D、G、J)新分离的PSC(B、 E、H、K)UCBSC克隆1G11和(C、 F、I、L)用抗体分析大鼠肌肉成纤维细胞(A、 B、C类)CD133(D、 E、F)β-连环蛋白(G、 H、I)PITX2和(J、 K、L)免疫荧光染色（红色）。干/祖细胞相关蛋白CD133、PITX2和numb仅限于PSC和UCBSC，而β-catenin出现在所有细胞类型中。在(D类)PSC和(E类)细胞核中检测到UCBSCβ-连环蛋白，表明β-连环素依赖的WNT信号传导活跃(F类)而成纤维细胞主要在细胞膜上显示β-连环蛋白。细胞核用DAPI（蓝色）染色。
图6
图6。PSC可分化为肝细胞样细胞在体外.
PSC在培养中扩增7天，随后在培养基中再培养14天(A类)IMDM补充10%FCS（控制介质）或(B类)含细胞因子的IMDM（FGF4、HGF）、亚油酸白蛋白和ITS（肝细胞分化培养基）。(B类)细胞因子治疗期间，PSC原代培养物中出现肝细胞样细胞。(C类)在对照条件下，原代培养的PSC不表达免疫荧光（红色）研究的肝细胞标志物细胞角蛋白18（CK18），但(D类)经肝细胞分化培养液处理14天后，诱导CK18合成。(E类)肝细胞相关胆汁盐输出泵（BSEP；红色）在对照组表达波形蛋白的PSC（绿色）中仍然检测不到，而(F类)肝细胞分化培养液处理的PSC中检测到BSEP和波形蛋白。细胞核用DAPI（蓝色）标记。(G公司)通过RT-PCR分析对照组（IMDM和10%FCS；左栏）和细胞因子处理的PSC（FGF）中星状细胞（GFAP，α-SMA）以及未成熟和成熟肝细胞（HHEX，CYP7A1，α-胎蛋白，白蛋白，CX32，HNF1α，HNF4α，HNP6，MRP2）的分子标记物4HGF、亚油酸白蛋白和ITS；右栏）。notch3和通常由肝实质细胞表达的基因的诱导表明细胞分化。(H（H）)PSC克隆也保留了这种细胞分化潜能，在细胞因子处理7天后，PSC克隆显示出类似的表达模式（右栏）。在对照组中，在不含细胞因子的培养基（IMDM和10%FCS；左栏）中培养克隆扩增的PSC。(我)PSC克隆显示了肌纤维母细胞样细胞的形态（对照组），但(J型)经肝细胞分化培养基处理7d后，发育成肝细胞样细胞。(K（K）)在这个实验装置中，白蛋白的释放是通过大鼠特异性白蛋白ELISA测定的。原代培养的PSC和PSC克隆2F5经肝细胞分化培养基处理后可分泌大量白蛋白，而在对照条件下或无细胞的实验培养基中（n=3）未检测到大鼠白蛋白。
图7
图7。移植eGFP的贡献+PSC对肝再生的影响体内.
(A类)PSC中eGFP荧光（绿色）培养7天。(B类)这些培养物激活的eGFP+将PSC移植到在2AAF存在下接受PHX的野生型大鼠体内。eGFP+移植后14天，通过eGFP（绿色）免疫荧光染色检测PSC到达宿主肝脏。(C、 D类)eGFP+通过eGFP荧光（绿色）和核HNF4α免疫荧光（红色）的共同定位确定PSC在宿主肝脏中分化为肝细胞。(E类)eGFP（绿色）和细胞角蛋白18（CK18；红色）的联合免疫荧光染色也证实了它们向肝细胞的分化。移植的eGFP的命运+通过eGFP表达细胞（红色）的快速红染色，用免疫组织化学法进一步分析PSC。(F、 G公司)野生型Wistar大鼠的肝脏在与eGFP抗体孵育后没有显示出快速红染色(H（H）)但当eGFP+移植PSC后，宿主肝脏大面积呈红色(我)肝细胞（黄色箭头）和(J、 K（K）)胆管细胞（白色箭头）。(J型)快速红染色显示，靠近胆管（黑箭头）和肝窦（黄箭头）的其他细胞类型也显示eGFP表达。(L（左）)eGFP（绿色）和CK19（红色）的联合免疫荧光进一步证实了宿主肝胆管中存在eGFP表达细胞。(M（M）)用Y染色体的HNF4α（红色）和FISH（绿色）免疫荧光染色鉴定在2AAF（白色箭头）存在下PHX后14天移植雄性PSC的雌性肝组织中的肝细胞。同时检测到Y染色体的非实质细胞（黄色箭头）。(N个)Y染色体（绿色）的FISH和panCK（红色）的免疫荧光染色联合显示，移植的PSC已分化为形成胆管的胆管细胞。(O、 P（P）)克隆扩增的雄性PSC也被移植到野生型雌性大鼠体内，这些雌性大鼠在2AAF存在下接受PHX治疗。Y染色体FISH（绿色）和免疫荧光染色(O（运行）)HNF4α（红色）或(P（P）)panCK（红色）表明，再生14天后，PSC的单细胞克隆分化为肝细胞和胆管细胞（白色箭头）。(P（P）)此外，在胆管附近发现了不表达细胞角蛋白的PSC衍生细胞（黄色箭头）。细胞核用DAPI（蓝色）标记。
图8
图8。野生型宿主肝脏中PSC衍生细胞的估计。
(A类)为了量化移植eGFP的贡献+细胞移植后14天进行肝再生PSC、eGFP DNA定量PCR检测。eGFP表达大鼠和野生型大鼠的肝脏分别作为eGFP基因的阳性和阴性对照。对10个不同动物的样本进行测量，以评估PSC移植后肝脏的eGFP表达。(B类)雄性PSC性别不匹配移植到雌性受体大鼠（n=4）后，通过雄性特异性SRY DNA的qPCR进一步验证了星状细胞的植入。与PSC相比，肌肉成纤维细胞无法在宿主肝脏中存活（n=4）。
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出版物类型

赠款和资金

这项工作得到了德国研究基金会通过合作研究中心CRC 974（“肝损伤和再生期间的通信和系统相关性”）和杜塞尔多夫海因里希·海因大学医学院研究委员会的支持。资助者在研究设计中没有任何作用，数据收集和分析、决定出版或准备手稿。