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.2012年11月；14(11):1005-14.
doi:10.1593/neo.121212。

靶向TORC1/2提高头颈癌临床前模型对EGFR抑制剂的敏感性

安德烈·卡塞尔 1, 玛丽亚·弗雷利诺, 杰西卡·李, 沙伦·巴尔, 王林（Lin Wang）, 玛丽·帕纳汉德赫, 苏菲·M·托马斯, 詹妮弗·格兰迪斯
附属公司

靶向TORC1/2提高头颈癌临床前模型对EGFR抑制剂的敏感性

安德烈·卡塞尔等。 肿瘤形成. 2012年11月.

摘要

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的特征是表皮生长因子受体（EGFR）的过度表达，靶向EGFR的治疗在临床上的成功率有限。阐明在EGFR阻断情况下保持激活的关键下游通路可能揭示新的治疗靶点。本研究旨在验证以下假设：抑制雷帕霉素（mTOR）复合物的哺乳动物靶点将增强HNSCC临床前模型中EGFR阻断的效果。用新开发的TORC1/TORC2抑制剂OSI-027/ASP4876处理HNSCC细胞株，导致增殖的剂量依赖性抑制，并消除已知下游靶点的磷酸化，包括磷酸化AKT（Ser473）、磷酸化4E-BP1、磷酸化p70s6K和磷酸化PRAS40。此外，OSI-027和厄洛替尼联合治疗可增强体外生化效应和协同生长抑制。与单独治疗相比，联合使用美国食品和药物管理局（FDA）批准的EGFR抑制剂西妥昔单抗和OSI-027治疗携带HNSCC异种移植物的小鼠，肿瘤体积显著减少。这些发现表明，TORC1/TORC2抑制联合EGFR阻断是治疗HNSCC的一种可行策略。

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数字

图1
图1
HNSCC细胞对OSI-027的生长抑制比雷帕霉素更敏感。代表性HNSCC细胞系（PCI-15B、Cal 33、UMSCC1、686LN和FaDu）在100个细胞中以5000个细胞的密度进行电镀µ我在一个96英尺的板块的每个井里。用（A）雷帕霉素或（B）OSI-027处理细胞3天，一式三份，然后进行CellTiter-Glo检测。对于每个细胞系，三次获得EC50值，结果相似。
图2
图2
OSI-027在HNSCC细胞系中以剂量依赖性方式抑制TORC1和TORC2下游靶点。将HNSCC细胞（A）UMSCC1和（B）Cal 33用增加浓度的OSI-027（0.3、0.5、0.75、1和1.25）处理24小时µM） 或DMSO作为对照。然后对磷酸化的p70s6K、AKT（Ser473）、PRAS40和4EBP1的总水平进行蛋白质印迹分析。β-管蛋白作为负荷对照。（C） 用EC处理HNSCC细胞（UMSCC1和Cal 33）50OSI-027的值（0.5µM代表UMSCC1和Cal 33）或雷帕霉素（13µUMSCC1和20的MµM代表Cal 33）。DMSO被用作车辆控制。细胞处理24小时，然后进行磷酸化AKT（Ser473）和总AKT的Western blot分析。β-管蛋白作为负荷对照。实验重复了三次，结果相似。
图3
图3
用OSI-027和厄洛替尼联合治疗可协同抑制细胞存活。将HNSCC细胞（A–D）UMSCC1和（E–H）Cal 33以1000个细胞/孔的密度，在96个孔板中，在DMEM+10%FBS中的6孔板的4个孔中进行电镀。第二天，用0.5µM OSI-027，厄洛替尼（3µM代表UMSCC1细胞和4µM代表Cal 33细胞），或两种药物在这些浓度下联合使用5天。通过Kruskal-Wallis精确测试（Statxact软件，第7版）测试治疗组之间的差异。剂量效应曲线和等辐射热图显示了联合治疗的协同效应。协同作用是使用Chou和Talalay的CI值确定的，值小于1表示协同作用。实验重复至少三次，结果相似。
图3
图3
OSI-027和厄洛替尼联合治疗可协同抑制细胞存活。将HNSCC细胞（A–D）UMSCC1和（E–H）Cal 33以1000个细胞/孔的密度，在96个孔板中，在DMEM+10%FBS中的6孔板的4个孔中进行电镀。第二天，用0.5µM OSI-027，厄洛替尼（3µM代表UMSCC1细胞和4µM代表Cal 33细胞），或两种药物在这些浓度下联合使用5天。通过Kruskal-Wallis精确测试（Statxact软件，第7版）测试治疗组之间的差异。剂量效应曲线和等压线图显示了联合治疗的协同效应。协同作用是使用Chou和Talalay的CI值确定的，值小于1表示协同作用。实验重复至少三次，结果相似。
图4
图4
OSI-027和厄洛替尼联合治疗可增强HNSCC细胞系中TORC1和TORC2下游靶点的抑制作用。HNSCC细胞（A）UMSCC1和（B）Cal 33用（0.5µM代表UMSCC1和Cal 33），厄洛替尼（3µUMSCC1和4的MµM代表Cal 33），或两种药物在这些浓度下的组合。DMSO用作对照。细胞处理24小时，然后进行已知TORC1和TORC2底物的Western blot分析。检测细胞的磷酸化AKT（Ser473）和总AKT、磷酸化PRAS40和总PRAS40、磷酸化p70s6K和总p70s6 K、磷酸化4E-BP1和总4E-BP1。通过Kruskal-Wallis精确测试（Statxact软件，版本7）测试治疗组的差异。β-管蛋白作为负荷对照。实验重复了三次，结果相似。
图5
图5
OSI-027和西妥昔单抗联合使用可增强抗肿瘤作用体内.皮下接种5×10厚皮裸鼠5Cal 33细胞。在肿瘤可触及后，39只小鼠被随机分为四组，并用其中一种载体进行治疗(n个=9），OSI-027(n个= 10; 每日50 mg/kg剂量，经口灌胃），西妥昔单抗(n个= 10; 每周两次剂量0.02 mg，i.p.），或西妥昔单抗和OSI-027的联合用药(n个= 10; 上述剂量）。每周测量三次肿瘤体积，持续14天。（A） 与单一药物相比，OSI-027和C225联合治疗显著降低肿瘤生长(P（P）= 0.001). 通过Kruskal-Wallis精确测试（Statxact软件，第7版）测试治疗组之间的差异。评估异种移植肿瘤的（B）Ki67阳性细胞的百分比和（C）每个高功率场的TUNEL阳性细胞的平均数量。
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