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.2013年2月1日；19(3):560-70.
doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-2334。 Epub 2012年12月4日。

SLC1A5介导肺癌细胞生长和生存所需的谷氨酰胺转运

穆罕默德·哈萨内因 1, 梅根·D·霍克塞马, 佐田正男（Masakazu Shiota）, 钱军, 布拉德福德·K·哈里斯, 陈海蒂（Heidi Chen）, 乔纳森·克拉克, 威廉·埃尔伯恩, 罗莎娜·艾森伯格, 皮埃尔·P·马西安
附属公司

SLC1A5介导肺癌细胞生长和生存所需的谷氨酰胺转运

穆罕默德·哈萨内因等人。 临床癌症研究. .

摘要

目的：我们之前在I期非小细胞肺癌（NSCLC）的鸟枪蛋白质组分析中，与匹配的对照组相比，已确定溶质结合载体家族A1成员5（SLC1A5）是一种过度表达蛋白。我们假设SLC1A5的过度表达是为了满足肺癌细胞生长和生存的代谢需求。

实验设计：为了验证我们的假设，我们首先通过免疫组织化学和免疫印迹分析了存档肺癌组织（N=98）和细胞系（N=36）中SLC1A5的蛋白表达。为了检测SLC1A5参与氨基酸转运，我们对存在或不存在SLC1A5-γ-谷氨酰胺基-对-硝基苯胺（GPNA）药物抑制剂的肺癌细胞株中l-谷氨酰胺（Gln）的摄取进行了动力学分析。最后，我们研究了谷氨酰胺剥夺和摄取抑制对五种肺癌细胞系的细胞生长、细胞周期进展和生长信号通路的影响。

结果：我们的结果表明：（i）SLC1A5蛋白在95%的鳞状细胞癌（SCC）、74%的腺癌（ADC）和50%的神经内分泌肿瘤中表达；（ii）SLC1A5位于细胞质膜上，与SCC组织学和男性显著相关；（iii）68%的Gln以Na（+）依赖性方式运输，其中50%归因于SLC1A5活性；和（iv）SLC1A5的药物和基因靶向性降低了肺癌细胞的细胞生长和生存能力，这种作用部分由mTOR信号介导。

结论：这些结果表明，SLC1A5在控制肺癌细胞代谢、生长和生存的谷氨酰胺转运中起着关键作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

没有披露潜在的利益冲突。

数字

图1
图1。SLC1A5在NSCLC肿瘤中差异表达，位于细胞质膜水平
（A） 组织微阵列（TMA）中SLC1A5蛋白的IHC染色代表性图像，该微阵列是从98例代表主要肺癌组织亚型的肺癌患者的存档肺组织切片中构建的。左面板由3张代表性的显微照片组成，放大100倍，取自SLC1A5染色阴性的肺癌患者的正常肺组织切片。右侧面板由IIA期ADC和IIB期SCC患者肺癌切片的代表性放大100倍显微照片组成。将右上角相同部分的小区域放大200倍，可以看到癌细胞的膜染色模式。这里也显示了一段没有SLC1A5染色的ADC。（B） SLCA15蛋白IHC指数（强度×肿瘤细胞百分比）的方框图显示染色指数显著升高(p<0.001)男性（N=56）的肿瘤数高于女性（N=42）。（C） SLCA15蛋白IHC指数的方框图显示，与ADC相比，SCC中的IHC染色指数显著增加(p<0.001). 表1提供了我们的IHC分析的详细摘要。
图2
图2。Gln摄取为Na+-依赖并部分由SLC1A5介导
为了检查Gln的细胞内转运，将人ADC A549细胞以指定的细胞密度接种到24孔培养板（0.5 mL/孔）中。（A） Na人+-在37℃下监测1.6mM L-谷氨酰胺的依赖性摄取3分钟。每个点代表四次测定的平均±SEM。该图还说明了cholKRP（-Na）中谷氨酰胺速率的Michaelis–Menten动力学+)或NaKRP（+Na+)（A，右上），（+Na+)>（−钠+). （**p<0.005[n=3]）。（B） V（V）最大值在存在0、100和300µM GPNA的情况下，A549细胞的Gln摄取动力学值以及右上角的面板显示了谷氨酰胺速率的米氏动力学。（C） 在含有增加剂量GPNA的全生长培养基（+Gln+supp）中培养后，对A549生长%的剂量反应抑制。（D） 通过测量H2DCFDA（防爆488纳米/埃米斯525纳米)在增加GPNA剂量培养24小时后使用微量滴定板阅读器。这些数据代表了至少三个独立观察结果，结果为平均值±SEM。
图3
图3。谷氨酰胺是肺癌细胞生长所必需的在体外
为了测试SLC1A5的表达是否与体外肺癌细胞的Gln依赖性生长相关，在添加EGF、胰岛素、硒和转铁蛋白以及2mM L-谷氨酰胺（+Gln+Sup）的培养基中培养了5株表达水平不同的肺癌细胞系，或L-谷氨酰胺，但不含补充剂（+Gln-Sup），或不含L-谷氨酰胺但含补充品（−Gln+Supp），或既不含谷氨酰胺，也不含非补充剂。（B）细胞生长的倍数变化在第3天通过cell-Titer 96-水比色分析法分析为490时OD的变化纳米第0天的信号。生长抑制对Gln剥夺的敏感性在过度表达SLC1A5、A549、H520和HCC15的细胞系中显著，但在蛋白H1819和H727水平低或检测不到的细胞系则不显著。（C） 在补充或剥夺Gln的培养基中培养48小时后，通过台盼蓝排斥染料法测量Gln剥夺对表达SLC1A5的细胞系A549和H520的细胞活力的影响。（D） 使用以下方程式（Ti−Tz）/（C−Tz）×100，通过计算在补充或剥夺Gln或完全补充的培养基+1mM GPNA的培养基下培养48小时后细胞生长的净增加或减少来衡量Gln剥夺的抗生长效果。其中，Ti是生长刺激物或抑制剂处理48小时后的细胞数（i=抑制），Tz是时间零点的细胞数，C是在最佳生长条件（+Gln+Sup）下培养的对照细胞的细胞数。（E） 随着DON浓度的增加，A549和H1819治疗48小时后，细胞生长的剂量反应下降。通过学生t检验评估统计显著性，表示为*=p≤0.05，**=p≤0。005来自3个独立的测定。
图4
图4。谷氨酰胺耗竭和SLC1A5抑制对细胞周期进程的影响
（A） A549细胞在如下所述的各种生长条件下培养48小时后的典型亮场（20倍放大）图像。（B） 细胞周期阶段分布的DNA直方图4在添加了EGF、胰岛素、硒和转铁蛋白以及2mM L-谷氨酰胺（+Gln+Sup）、或L-谷氨酰胺但没有补充物（+Gln-Sup其中含有5mM GPNA。
图5
图5。SLC1A5的基因靶向性影响细胞生长和活性
（A） Western blot分析验证了转染25 nM干扰siRNA或指示浓度的抗SLC1A5抗体的A549和H520细胞中SLC1A5-蛋白的下调。在siRNA转染72小时后，使用台盼蓝染料排除法通过直接细胞计数分析细胞活力（B）和细胞生长（与第0天（C）相比）。（D） 在转染指定siRNA浓度72小时后，对A549细胞进行细胞周期分析。显示为平均值±SD的数据代表三个独立的实验。
图6
图6。SLC1A5介导的Gln摄取激活mTOR信号
通过western blot分析H520（SCC）和H1819（ADC）细胞系对谷氨酰胺剥夺或SLC1A5阻断的p-mTOR信号的磷酸化，评估mTOR、AKT和ERK信号的激活。细胞被剥夺生长因子，并用添加了EGF、胰岛素、硒和转铁蛋白的RPMI-1640培养基处理L-谷氨酰胺（饥饿）24小时，以及2mM的L-谷氨酸（+Gln+Sup）、L-谷氨酰胺但没有补充物（+Gln-Sup）或没有L-谷氨酰胺而有补充物（−Gln+Subp）或不补充L-谷氨酰胺或全生长介质+5mM GPNA（+Gln+Sup）60分钟。（A）Gln剥夺或GPNA处理对H1819细胞的mTOR或ERK信号无影响（SLC1A5为空）。（B） 在H520（SLC1A5过度表达）中，mTOR信号级联的激活被磷酸化的mTOR水平及其p70S6K和p85S6K的磷酸化所减弱。Gln剥夺或GPNA处理对H520细胞的AKT或ERK信号没有影响。
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