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.2013年2月；33(2):161-9.
doi:10.1038/jcbfm.2012.175。 Epub 2012年12月5日。

Bergman胶质细胞中的自发钙波随着年龄和缺氧而增加，并可能减少组织氧

克劳斯·马西森 1, 阿列克谢·布拉奇, 克里斯汀·汤姆森, 马丁·劳里岑
附属公司

Bergman胶质细胞中的自发钙波随着年龄和缺氧而增加，并可能减少组织氧

克劳斯·马西森等。 大脑血流代谢杂志. 2013年2月.

摘要

胶质钙（Ca（2+））波是一种在胶质细胞之间以及向邻近神经元和血管传播信号的手段。这些波在活体小鼠小脑皮质的Bergmann胶质细胞（BG）中自发发生。在此，我们检验了三个假设：（1）衰老和血氧饱和度降低会改变波活动；（2） 胶质细胞Ca（2+）波改变脑氧代谢；神经元和胶质细胞的波活动是相关的。我们在成年（8至15周龄）和衰老（48至80周龄）氯胺酮麻醉小鼠的小脑皮质中使用双光子显微镜，在单次加载OGB-1/AM和SR101后。我们的报告显示，与成年小鼠相比，衰老小脑皮质自发波的发生频率高出20倍，这与静息状态下大脑氧分压的降低有关。在成年小鼠中，随着静息脑氧分压的降低，自发胶质波活动增加，ATP诱发的胶质波降低了组织氧分压。最后，尽管自发性Purkinje细胞（PC）活性与胶质细胞波活性增加无关，但自发性胶质细胞波确实影响了PC细胞内Ca（2+）活性。衰老过程中的波活性增加以及静息脑氧分压降低，表明胶质细胞波、脑能量稳态、，和病理学。

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图1
图1
概述实验方法和设置，包括代表性数据示例。(A类)左：颅骨窗顶视图示意图，ATP移液管的位置和组织部分氧张力（tpO2)小脑皮质小叶VI中的电极a'和p'表示大脑的前后方向。右图：小脑皮层表面的荧光灰度图像。(B类)在表面（0）拍摄的双光子激光扫描显微镜图像μm、 左侧面板），70μ分子层（中间面板）和Purkinje细胞（PC）层（右侧面板）的m深度。TRITC-右旋糖酐用于血管可视化，而奥利冈绿BAPTA-1/AM作为钙（Ca2+)指示剂和硫罗丹明101（SR101）作为标记Bergmann胶质细胞（BG）的星形细胞标记物。右侧面板显示PC树突树的方向，如白色箭头所示，该箭头与大脑的前-后（a-p）轴一致。(C类)PC层的代表性高分辨率图像显示了大椭球PC体（一个标记PC）和围绕每个PC体的BG细胞体。少数不占用SR101的亮绿色细胞体可能是篮形细胞。(天)在分子层（左面板）水平上拍摄的具有代表性的时间平均灰度图像F类/F类0显示两个胶质细胞钙的图像2+waves（中间面板），以及使用多尺度视觉模型（右侧面板；绿色（顶部）和红色（左侧））从该图像序列中提取的胶质波的假染色。(E类)随着时间的推移，绿色标记的神经胶质波的扩展和发展。比例尺指示d的相对变化F类/F类0.
图2
图2
自发胶质细胞钙（Ca）的特征2+)波浪。(A类)45中心胶质细胞Ca最大增殖范围的绘制2+波浪。用深红色虚线标记的平均最大范围。外中距为63.1μm，前后（a-p）距离为51.2μ米(N个=45波，5只小鼠）。这些数据表明胶质细胞钙2+小脑皮层中的波向内侧延伸得比前后延伸得更远。(B类)左图：基于时间平均多尺度视觉的51个自发神经胶质波的最大范围（蓝线）和中心原点（红点）。右：左面板中的数据黑白再现，显示三个已识别的簇，分别有11个（红星）、10个（绿色三角形）和10个（蓝色方块）波，对应于60%的小波。其余40%的波与任何簇无关。使用自组织映射算法识别集群（参见材料和方法）。(C类)显示自发神经胶质波Ca传播的时间序列2+在4.1秒达到最大范围（黄色虚线），然后后退，最后在12.4秒消失。大约2秒钟后，第二个自发神经胶质波开始于前一个波的边界，向两侧扩展，但没有传播到第一个波的区域，这表明第一个波区域处于不稳定状态。
图3
图3
年龄依赖性自发神经胶质钙（Ca）增加2+)波活动和基底组织O减少2张力（tpO2). (A类)自发胶质细胞钙的小鼠发生率（%）2+与成年小鼠（14只小鼠中的3只；平均年龄10.1周；Kolmogorov–Smirnov试验，P（P）=0.00366). (B类)胶质钙2+波事件率（神经胶质波/10分钟/mm2)与成人队列相比，老龄队列中的差异显著（ANOVA，P（P）=0.00737). (C类)年龄与胶质细胞钙呈显著正相关2+同时分析两组时的波事件率（红线；斜率，0.276，R（右）2=0.289,P（P）=0.0033,数据流=23). 衰老小鼠的胶质波事件发生率高于成年小鼠(P（P）=0.00112，方差分析）。一只成年小鼠和八只老龄小鼠的胶质波事件率高于成年组的平均+2SD水平。(天)基本氧张力（tpO2)在衰老小鼠中显著降低(N个=5）比成年小鼠（ANOVA，P（P）=0.0301;N个=6只成年小鼠；左），但血氧饱和度（sO）没有差异2; 方差分析，P（P）=0.785; 右侧）。
图4
图4
自发胶质细胞钙（Ca2+)急性缺氧引起的波活动。(A类)原始数据显示诱导急性缺氧20分钟，如血液O减少所示2饱和度（第一次追踪）。急性缺氧以稳定的潮气末CO为特征2（第二次追踪）、稳定的动脉血压（第三次追踪）和脑组织O减少2张力（tpO2，第四个追踪）。(B类)显示自发胶质细胞Ca轮廓的伪彩色时间平均图像2+缺氧诱导前、中、后的波。急性缺氧期间胶质波事件率增加（第二组），恢复常压后继续增加（第三组）。恢复常压1小时后，胶质细胞波活性下降，但没有恢复到基线水平（第四组）。每个胶质细胞波用不同的颜色表示；等高线表示每个波的最大范围。(C类)总结O的箱线图2饱和度（蓝色方框，时间控制：虚线浅蓝色方框）和胶质波事件率（胶质波/10分钟/mm2，红色方框，时间控制：红色虚线方框）急性缺氧之前、期间和之后(N个=5). 在缺氧期间，五只小鼠中有三只小鼠的胶质波事件率增加，而在恢复常压20分钟后，五只老鼠中有四只进一步增加。在与缺氧组相同的时间段，在正常氧条件下进行时间控制记录(N个=8).
图5
图5
ATP诱发胶质细胞钙（Ca）的作用2+)组织O上的波2张力（tpO2). (A类)显示应用ATP加Alexa Fluor 954（红点用黑色箭头表示）如何诱发钙增加波的时间序列2+荧光（dF类/F类0)因为Bergmann胶质细胞活化。(B类)重复诱发神经胶质波的时间进程表明F类/F类0钙2+当用药间隔小于60秒时，振幅降低。以90秒（蓝色轨迹）和60秒（绿色轨迹）的注射间隔诱发可再现的反应。当以40秒（红色迹线）和20秒（黑色迹线）的间隔给予ATP时，响应幅度随着注射次数的增加而依次下降。(C类)tpO的同步记录2（蓝色轨迹）和dF类/F类0钙2+（红色轨迹）在以40秒的间隔三次应用ATP期间。两种反应都随着应用程序的数量而逐渐减少。注意，在同时记录胶质细胞波活动和tpO的过程中2、tpO2由于激光扫描产生高频噪声，电极位于双光子焦平面外。(天)平均tpO2对诱发胶质波的反应（±SEM，N个=3). tpO的初始增长2是ATP注入的伪影。tpO的减少2以黄色突出显示。(E类,F类)P2Y受体拮抗剂PPADS对dF/SD-Ca的影响2+和tpO2响应。ATP诱发的胶质波诱导Ca增加2+（dF/SD；E类)tpO减少2(F类). 两个响应（蓝色轨迹E类和F类)局部应用PPADS（500μmol/L，青色痕量E类和F类). 红色箭头表示PPADS应用之前（大箭头）和之后（小箭头）的响应。两张图中的插图显示了平均响应±SEM(N个=4个响应）。(G公司)tpO2响应（如所述测量F类)作为d的函数F类/SD钙2+振幅（按照E类)在应用PPADS（蓝圈）之前和之后诱发。PPADS抑制了两种tpO2和Ca2+伴随神经胶质波的振幅，导致正相关（红线；R（右）2=0.570,P（P）=0.00009,N个=4只小鼠）。
图6
图6
自发Bergmann胶质细胞（BG）和Purkinje细胞（PC）活性的聚类和相关分析。(A类)从一只鼠标的PC层获得的具有代表性的时间平均帧。描述了两台大型PC（～18μ直径为m），每个都被四个较小的BG细胞体（大的和小的虚线和虚线圆圈）包围。(B类)假彩色簇，其中的颜色表示簇活动的区域。一种正在繁殖的自发胶质细胞钙2+可以看到包裹PC的波（青色场），以及自发活动的PC（红点）。感兴趣的PC用“p”表示。(C类)d日F类/F类0从自发活动的BG（包括胶质波（蓝色、绿色、红色和浅蓝色线）和PC（包络线）中获得的随时间变化的痕迹(A类)（顶部，红色虚线圆圈）。Purkinje细胞增殖胶质钙2+波并不总是对周围的BG活动作出反应；当他们这样做时，PC的反应只是自发BG活动的一小部分。Purkinje细胞并没有启动波，因为BG在PC前有反应（插入）。(天)相关图显示dF类/F类0黄色PC中的值(A类)根据d绘制F类/F类0所有黄色BG的平均值(A类). 有一个小但显著的正相关(R（右）2=0.29529,P（P）<0.001). (E类)d日F类/F类0从自发活动PC（黑线）和周围BG（蓝色、绿色、红色和浅蓝色线）获得的随时间变化的痕迹(A类)（底部红色圆点），表明自发的PC活动没有扩散到BG(F类)显示数据的相关图F类/F类0中红色PC的值(A类)根据d绘制F类/F类0所有红色BG的平均值(A类). 自发PC活性与周围BG活性之间没有相关性，证实了自发PC活性不会激活BG的发现(R（右）2=0.002P（P）=0.259). (G公司)总结相关性的方框图(R（右）2)自发活动PC和周围BG之间（sPC-BG，蓝色，N个=36个来自三只小鼠的相互作用），自发神经胶质波（sBG-PC，绿色，N个=333来自4只小鼠的相互作用），以及自发活性BG之间的相互作用（sBG sBG，红色，336来自4只小鼠的相互作用）。虽然自发的PC活动没有扩散到周围的BG，但由活性BG组成的自发胶质波活动确实扩散到了PC，尽管其密度较低F类/F类0振幅。sPC→BG的正相关显著低于sBG→PC的正相关(P（P）=1.4 × 10−6)sBG→PC显著低于sBG～sBG(P（P）=0.0305).
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