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.2013年2月；5(2):235-49.
doi:10.1002/emmm.201201846。 Epub 2012年12月11日。

微粒暴露自身抗原是形成有效炎症成分的基础：微粒相关免疫复合物

纳塔莉·克鲁蒂尔 1, Sisareuth Tan公司, 吕克·布德劳, Catriona螃蟹, 鲁帕什雷·苏巴亚, 劳伦·拉希, 亚历山德拉·阿尔伯特, 鲁斯兰·施奈德, 鲁本·戈贝西, 彼得·阿尼格罗维奇, 理查德·法恩代尔, 威廉·罗宾逊, 阿兰·布里森, 大卫·M·李, 埃里克·波亚德
附属公司

微粒暴露自身抗原是形成有效炎症成分的基础：微粒相关免疫复合物

Nathalie Cloutier公司等。 EMBO分子医学. 2013年2月.

摘要

免疫球蛋白、抗原和补体可以聚集形成免疫复合物（IC）。IC可能有害，因为它们在自身免疫性疾病中传播炎症。与IC一样，免疫性关节炎患者的滑液中也存在称为微粒（MP）的亚微米细胞外囊泡。我们使用高灵敏度流式细胞术和电子显微镜检测了类风湿关节炎（RA）的MP。我们发现RA滑液中的MP在大小上高度不均匀。观察到的较大MP实际上是含MP的IC（mpIC），并且占可检测IC的大多数。这些mpIC经常表达整合素CD41，与血小板起源一致。尽管血小板衍生MPs表达Fc受体FcγRIIa，但我们发现mpIC的形成独立于该受体。相反，mpIC显示自身抗原波形蛋白和纤维蛋白原，抗瓜氨酸肽抗体对这些靶点的识别有助于mpIC的产生。在功能上，血小板mpIC具有高度的促炎性，可诱导中性粒细胞产生白三烯。综上所述，我们的数据表明血小板MP作为自身抗原表达元件具有独特的作用，能够使炎症IC的形成永久化。

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数字

图1
图1。MP在大小上是不均匀的，与PA SF相比，RA中的MP更丰富

  1. 答：。在改进了FSC-PMT小颗粒选项的Canto II流式细胞仪上采集直径为40–90 nm（平均值=90 nm，青蓝）、100–300 nm（平均数=220 nm，粉红色）、400–600 nm（平均价=450 nm，绿色）、700–900 nm（平均价格=840 nm，蓝色）、2500–4500 nm（平均价值=3200 nm，紫色）的荧光天蓝色微球。提出了一种基于微球尺寸（FSC-PMT）的100到3200nm范围内的比例尺，并用于确定微球的相对尺寸。

  2. B、 C、。附件五的FSC-PMT和SSC代表性描述+RA SF中检测到的事件(B)和PA SF(C)揭示了议员的维度多样性。根据尺寸定义的微球校准，给出了MP的相对尺寸。在RA SF中检测到两个主要亚群（亚群1和亚群2(B)而在PA SF中仅观察到一个（子顶部1）(C)在图表上标识。

  3. D。使用Annexin-V标记检测到的RA SF中MP的Triton®声波风廓线仪敏感性为未治疗（对照）的%。

  4. E.公司。膜联蛋白-V的流式细胞术定量+RA和PA SF中包含的议员(n个=23 RA和n个=18帕***对= 0.0004). 统计分析如图所示。数据为平均值±SEM。

图2
图2。RA SF中mpIC的可视化
分别使用蛋白A结合金纳米粒（10 nm）和膜联蛋白V结合金纳米粒子（4 nm）对免疫球蛋白和磷脂酰丝氨酸暴露MPs进行冷冻TEM检测。

  1. A、 B。使用RA SF获得的代表性观察结果，其中MP[标有MP（MP 1和MP 2（A）和MP（B）的白盒]与直径为～2µm的mpIC共定位。白色箭头表示检测到MP的IC边缘。黑色箭头表示用于TEM的多孔支撑膜的碳基体。插图（底部面板）包括单独的MP。使用蛋白A结合纳米球（10 nm）检测到的免疫球蛋白用白色箭头表示，使用附件V结合纳米球检测到的MP用黑色箭头表示。请注意，一些议员的Annexin-V呈阴性。

  2. C、。相对较小的mpIC也被可视化。白色和黑色箭头分别表示免疫球蛋白和磷脂酰丝氨酸。比例尺显示在每个面板下。

图3
图3。RA SF型mpIC中的MP，包括血小板MP

  1. 用FITC-结合的膜联蛋白-V和Cy5-结合的抗IgG组合标记的代表性RA SF的FSC-PMT和SSC点图，以证明膜联蛋白V表面存在IgG+议员。四象限闸门根据同型控制进行定位。议员（附件五+-免疫球蛋白G−)蓝色显示的尺寸大多在100至300纳米之间（下插图），而mpIC（膜联蛋白-V+-免疫球蛋白G+)绿色的尺寸为700到3000纳米（上部插图）。相对直径是根据尺寸定义的微球校准给出的。

  2. RA和PA SF中包含的mpIC数量(n个=23 RA和n个=18 PA***对< 0.0001).

  3. 相对RA SF中可检测IC总量的mpIC数量(n个= 23). 统计分析显示在每个图表下。数据为平均值±SEM。

  4. 用FITC-结合的Annexin-V和Cy5-结合的抗IgG组合标记的代表性PA SF的FSC-PMT和SSC点图。

  5. 用PE-结合抗CD41和Cy5-结合抗IgG标记的RA SF患者的FSC-PMT和SSC点图。四象限闸门根据同型控制进行定位。CD41的存在+MPs（绿色区域）的CD41和IgG双重表达证明了mpIC。本文介绍了两名患者的RA SF，以说明患者之间存在的异质性。

  6. CD41的定量+RA和PA SF中的mpIC(n个=25 RA和n个=18 PA***对= 0.0006). 统计分析显示在每个图表下。数据为平均值±SEM。

  7. CD41的Triton®声波风廓线仪灵敏度+RA SF中包含的mpIC占未治疗（对照）CD41的百分比+mpIC。

图4
图4。血小板MP独立于CD32a形成mpIC

  1. A、 B。通过hs-FCM和Western blot分析（插入A类). 生成血小板MP在体外血小板GPVI刺激后(A类)使用Annexin-V检测RA SF中的内源性MP(B). 蓝色：同型；灰色：特异性CD32a标记(n个= 3).

  2. C、。荧光血小板的FSC-PMT和SSC图谱（顶部面板）和血小板MP（底部面板）(n个= 10). 根据尺寸定义的微球校准给出了相对尺寸。

  3. D–G类。在RA和PA-SF中培养外源性荧光血小板MP后获得的结果(n个=10 RA和n个=18 PA）。(D类)使用RA（顶部）和PA SF（底部）获得的代表性FSC-PMT和SSC图。RA中检测到两个亚群（subpop）（1和2），而PA SF（1）中仅检测到一个亚群。(E类,F类)hs-FCM评估RA培养后MP表面IgG的存在(E类)和PA SF(F类)使用Cy5-结合抗IgG抗体。四象限闸门根据同型控制进行定位。(E类)议员（绿色）为IgG−和显示的尺寸范围为100至300 nm（下插图），而mpIC（蓝色）的尺寸范围是700至3000 nm（上插图）。(D类,E类)根据尺寸定义的微球校准给出了相对尺寸。(G公司)在没有CD32a阻断抗体（第一和第三列）或存在CD32a封闭抗体（第二列）的情况下测定mpIC的hs-FCM定量对=0.4478（未配对t吨-测试），第1列和第3列***对< 0.0001). 统计分析如图所示。数据为平均值±SEM。

图5
图5。血小板MP显示由RA SF的IgG识别的瓜氨酸化自身抗原

  1. A、 B利用抗瓜氨酸抗体及其对应的与Alexa 647偶联的二级抗体，通过hs-FCM测定血小板MP上瓜氨酸表位的存在。使用PE结合的抗CD41抗体确认MP来源于血小板。(A类)血小板MP上瓜氨酸抗原的存在是在在体外血小板MP（左面板）和RA SF的MP（右面板）。垂直线根据同型对照定位。粉红色：阴性人群；蓝色：阳性人群。血小板MPs阳性的百分比显示在图表上。(B)瓜氨酸的定量+CD41型+RA和PA SF的议员(n个=8 RA和n个=8 PA*对= 0.0148).

  2. C、 D类从血小板MP中获得的蛋白质在体外在SDS–PAGE上分离左侧未修饰（−PAD4）或瓜氨酸化（+PAD4。在RA存在的情况下培养细胞膜(C)或PA(D类)利用HRP-结合的抗人IgG显示SF和SF自身抗体对MP-衍生自身抗原的识别。箭头表示当MP被瓜氨酸化时，SF中的IgG唯一识别的蛋白质。两个RA和PA SF用于说明患者之间存在的变异性(n个=12 RA和n个=8 PA）。

图6
图6。RA SF患者血小板MP呈现自身抗原

  1. 答：。CD41中自身抗体的鉴定+RA SF中的mpIC。mpIC稀释的IgG与40种抗原的结合特异性是在Bio-Plex™基于珠的抗原阵列上测定的，并且只提供具有显著结合性的抗原(n个=23名RA患者，确定为1–23）。颜色表示结合量：无法检测（蓝色）；结合力逐渐增强（绿色、黄色、红色）。色阶显示在右侧。阴性对照（C）通过在SF中培养同种抗体获得。Cfc；环瓜氨酸化丝聚蛋白，H2A/a；组蛋白H2A/a。

  2. B–D类。检测自身抗原的存在在体外hs-FCM检测RA SF中的血小板MP（左）和血小板MP（右）(n个= 4). (B)MPs与抗波形蛋白孵育，并使用Alexa 647-共轭二级抗体显示相互作用。(C)MPs与外源性Alexa 647-荧光纤维蛋白原孵育，并通过hs-FCM量化相关性。(D类)MPs与抗纤维蛋白原孵育，并使用Alexa 647结合二级抗体测定与内源性纤维蛋白原的相互作用。垂直线根据同型对照定位。绿色：阴性人群；蓝色：阳性人群。阳性MP的百分比显示在图表上。

图7
图7。血小板mpIC促进中性粒细胞产生白三烯

  1. 在RA SF mpIC存在下培养的中性粒细胞对白三烯生物合成的定量[n个=3名不同的患者***对<0.0001例患者1和2**对=0.0011患者3（未配对t吨-测试，相对于PBS控制）]。数据为平均值±SEM。测得的白三烯代表LTB4、6-反式-LTB4、12-epi-6-反式-LTB4、20-OH-LTB4和20-COOH-LTB4s的总和。

  2. 血小板MPs与抗纤维蛋白原共同孵育后，血小板mpIC迅速形成在体外mpIC的代表性FSC-PMT和SSC点图。形成了mpIC在体外使用FITC-结合的Annexin-V和Alexa 647-结合的二级抗体的组合证明。根据同种型对照对四象限闸门进行定位。议员（附件五+-免疫球蛋白G−)蓝色显示的尺寸大多为100至500 nm（下插图），而mpIC（附录-V+-免疫球蛋白G+)以800到3000纳米的紫色显示尺寸（上部插图）。根据尺寸定义的微球校准给出了相对尺寸。

  3. 中性粒细胞在白三烯存在下的生物合成定量在体外mpIC、抗纤维蛋白原和血小板MP。与其他条件相比，mpIC的刺激效力具有统计学意义[n个= 3 ***对≤0.0001（未配对t吨-测试）]。数据为平均值±SEM。测量的白三烯代表LTB4、6-反式-LTB4、12-表-6-反式-LTB4、20-OH-LTB4和20-COOH-LTB4的总和。

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