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。2014年2月；24(2):508-20.
doi:10.1093/cercor/bhs332。 Epub 2012年10月31日。

piggyBac转座酶的命运图显示，在大鼠新皮层中，新皮质GLAST+祖细胞比Nestin+祖细胞产生更多的星形胶质细胞

费斯·西迪奇 1, 陈富毅, 亚伯拉罕·瓦隆, 克里斯托弗·费恩德拉, 科马尔·帕特尔, 约瑟夫·洛特科
附属公司

通过piggyBac转座酶绘制的命运图显示，在大鼠新皮质中，新皮质GLAST+祖细胞比Nestin+祖细胞产生更多的星形胶质细胞

费斯·西迪奇等。 大脑皮层。 2014年2月。

摘要

新皮质脑室区（VZ）内的前体细胞首先生成锥体神经元，然后生成星形胶质细胞。我们将新的piggyBac转座子酶谱系追踪方法应用于大鼠新皮层Nestin或谷氨酸和天冬氨酸转运体（GLAST）启动子活性阳性的命运图祖细胞群体。胚胎第13天（E13）的GLAST+和巢蛋白+祖细胞产生含有相似比例的神经元和星形胶质细胞的谱系。到E15，GLAST+祖细胞群体显著分化，产生的谱系中星形胶质细胞相对于神经元的数量是Nestin+群体的5-10倍。为了确定GLAST+和Nestin+群体中出生的后代何时分化，我们使用了Cre/loxP命运定位系统，在该系统中，细胞分裂后质粒丢失。到E18，GLAST+祖细胞的出生后代产生的新皮质星形胶质细胞是Nestin+祖细胞的2-3倍。最后，我们使用多色克隆标记方法显示，E15标记的GLAST+群体产生的星形胶质细胞祖细胞比Nestin+群体产生更大、空间受限的克隆簇。这项研究提供了体内证据，证明通过中层皮质发生（E15），VZ祖细胞群体在生成星形胶质细胞和神经元的潜力方面显著多样化。

关键词：Cre/loxP；命运规范；谱系追踪；新皮质；piggyBac转座子系统。

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数字

图1。
图1。
PiggyBac公司转座子和CRE质粒系统用于命运定位。(A类)示意图显示了Cre/loxP（上位体）和猪背肉转座子系统。用外膜Cre/loxP质粒转染导致GFP仅标记立即生成的子代，在这种情况下，是一个神经元而不是谱系中的其他细胞，然而，用猪背肉质粒导致GFP转基因稳定整合到祖细胞基因组中，从而标记完整的神经元和星形细胞谱系。(B类)通过上位质粒转染创建的出生日期命运图示例。在E13、E14、E15、E17和E18处转染CAG-Core+CALNL-GFP的祖细胞在P21处收获时显示出生后神经子代的连续出生日期，在标记的队列中几乎没有重叠。E13–17 IUE生成GFP+新皮质锥体神经元，逐渐占据更浅层的层，而E18 IUE显示在更深层中额外存在分散的星形胶质细胞（白色箭头）。插图显示了具有顶端树突和多个基底外侧树突的皮质神经元的示例。E18插图还显示了原生质星形胶质细胞的示例。(C类)P15处采集的PiggyBac质粒与CAG-mRFP（上位质粒）在E15处共电穿孔，显示转染祖细胞占据新皮质2/3层的直接子代（红色通道中的mRFP）。绿色通道（GFP）显示2/3层GFP+神经元，许多分散的GFP+灰质星形胶质细胞（白色箭头）跨越多个新皮质层。合并后的图像显示，许多2/3层神经元为mRFP+/GFP+，而星形胶质细胞为mRFP−/GFP+。(D类)CAG-PBase、GLAST-PBase和Nestin-PBase组中标记的少突胶质细胞的图像示例。(E类)嗅球中间神经元标记GFP。高倍镜显示典型的肾小球周细胞和颗粒细胞。G代表golmerulus。比例尺：B类=200微米；插入=20μm；C类=100微米。
图2。
图2。
来源于GLAST+祖细胞的谱系在E15处含有明显多于巢蛋白+祖细胞的星形胶质细胞。(A类——C类)转染二进制基因的胚胎大鼠新皮质IUE猪背肉转座子质粒在E13处，在P15处收获。共电泳三种表达载体：Nestin PBase或GLAST PBase+ZG-s（供体质粒）+CAG mRFP（转染对照）。采集冠状切片并成像。(A类)内斯汀猪背肉条件显示，新皮质深层的mRFP+神经元与早期神经发生时产生的直接后代一致，而完整的谱系包括后期生成的上层GFP+神经元（仅绿色）和星形胶质细胞。(B类)格拉斯特猪背肉情况显示GFP+星形胶质细胞和GFP+锥体神经元。(C类)Nestin（94±1%神经元vs.6±1%星形胶质细胞）和GLAST（85±2%神经元vs.15±2%星形胶质细胞(n个=3个大脑，4-6片/大脑）。比例尺：A类=100μm。(D–F)转染任何二元Nestin的胚胎大鼠新皮质IUE猪背肉或GLAST猪背肉E15处的转座子质粒和P15处的收获。共电穿孔三种表达载体：Nestin-PBase或GLAST-PBase+ZG-s+CAG-mRFP。采集冠状切片并成像。(D类)与GLAST-PBases相比，Nestin启动子条件下新皮质中相对于星形胶质细胞含有更多的神经元(E类)在皮层中含有丰富的星形胶质细胞。白色箭头表示两种情况下GFP+星形胶质细胞的例子。大多数神经元为GFP+/mRFP+，占据2/3层，而星形胶质细胞为GFP+/mRFP−。(F类)Nestin（86±2%神经元vs.14±2%星形胶质细胞）和GLAST（37±3%神经元vs.63±3%星形胶质细胞(n个=每种情况下3-4个大脑，每个大脑4片；P（P）<0.001，双向方差分析）。比例尺：A类=100微米。(G公司)从E13到E15，线性标记的星形胶质细胞（GFP+/mRFP−）与神经元（GFP+/mRFP-）之比的比较表明，E13和E15之间存在显著差异(n个=每种情况4个大脑，每个大脑4片；双向方差分析，年龄×启动子，P（P）< 0.05).
图3。
图3。
GLAST+/Nestin−祖细胞来自GLAST+/Nestin+群体。(A类)跟踪GLAST标记的祖细胞群体变化的实验设计示意图。早期胚胎（E13）大鼠新皮质祖细胞与GLAST启动子驱动PBase（辅助质粒）+ZG-s（供体质粒）共电穿孔，其中包含eGFP表达盒。在电穿孔后12 h（E13.5）、72 h（E16）和120 h（E18）时采集大脑，并将其急性分离、电镀并标记GLAST和Nestin标记物，以确定它们在总GFP标记细胞中的相对比例。GLAST的显微解剖和分离示意图猪背肉转染大鼠脑中GFP标记的VZ细胞。使用荧光解剖显微镜对胚胎进行解剖，并将转染的胎鼠混合以富集GFP标记的细胞。在6-8小时内对培养物中的解离细胞进行免疫细胞化学，以使细胞粘附并获得最佳免疫反应性。(B类)E13 IUE后E13.5、E16和E18分离细胞的荧光图像。绿色通道（GFP）显示散在的GFP+细胞，具有始终如一的GLAST免疫反应性祖细胞形态（红色通道）。巢蛋白免疫反应性（蓝色通道）在E13.5处显示最大表达，随后随着时间的推移表达减少。合并的图像显示绿色、红色和蓝色通道的重叠。(C类)显示胚胎神经发育期间GLAST和Nestin种群差异的线形图。总GLAST的96±1%至98±1%猪背肉GFP+细胞为GLAST免疫反应性细胞，而该百分比在E18时从96±1%（E13.5）降至80±4%（E16）至70±1猪背肉GFP+/Nestin+细胞。(D类和E类)E16新皮质VZ的双重免疫标记切片显示大多数但不是所有细胞中普遍存在GLAST免疫反应性和Nesting反应性。饼图显示了被GLAST和Nestin抗体（黄色）、GLAST但不被Nestin（红色）、Nestin和GLAST都没有标记的细胞百分比（绿色；C类;n个=每个时间点从8个到10个汇集大脑的5个覆盖滑动；P（P）<0.0001，双向方差分析）。比例尺：B类=20微米。
图4。
图4。
Nestin+和GLAST+祖细胞的直系后代产生类似的锥体神经元类型。胚胎大鼠新皮质祖细胞在E15与Nestin-Cre或GLAST-Core+CALNL-GFP共电穿孔，并在P21收获。(A类)Nestin和GLAST阳性祖细胞群体都产生了GFP+新皮质神经元，它们占据了新皮质的2/3深层。参照软脑膜表面分析神经元的层流位置（详见材料和方法）。大多数来自CAG（70±3%）、Nestin（82±5%）和GLAST（77±9%）条件的GFP+神经元占据第4层，对应于深层2/3(n个=2–3个大脑，每个大脑3片）。(B类)在CAG、Nestin和GLAST条件下用CUX1和CTIP2标记GFP+神经元（左），并量化GFP和CUX1双阳性神经元（右）。CAG、Nestin和GLAST条件下GFP+神经元对标记物CUX1和CTIP共阳性的百分比的量化显示，大多数锥体细胞为CUX1免疫阳性细胞，少数CTIP双阳性细胞在不同条件下无显著差异(n个=2-3个大脑，每个大脑4-6片）。(D类)Nestin+和GLAST+谱系中CUX1阳性的仅GFP神经元的百分比没有差异。箭头表示GFP/CUX1阳性锥体神经元，箭头表示GFP、RFP和CUX1三重标记的锥体神经元。量化结果显示在条形图中(n个=2-3个大脑，每个大脑5-6片）。比例尺：A类=200微米；B类=20微米；和C类=20微米。
图5。
图5。
在E18，GLAST+祖细胞比Nestin+祖细胞产生更多的星形胶质细胞后代。新皮质祖细胞在E18与Nestin-Cre或GLAST-Core+漂浮GFP表达载体共电穿孔，并在P21处收获。冠脉切片用抗GFP一级抗体染色，用二氨基苯甲醛过氧化物酶底物检测光镜。(A类)形态学分析显示，在两种启动子条件下都存在浅层2锥体神经元（白色箭头所示）和灰质星形胶质细胞。(B类)免疫组织化学分析证实，具有星形细胞形态的成熟星形细胞标记物胶质纤维酸性蛋白和S100β阳性。(C类)GFP+神经元和星形胶质细胞百分比的量化显示，与CAG对照条件相比，Nestin和GLAST启动子的命运输出不同（72±2%神经元vs.28±2%星形胶质细胞）。与GLAST（55±3%的神经元对45±3%的星形胶质细胞）相比，巢蛋白状态（79±4%的神经元对21±4%的星形胶质细胞）的神经元显著富集，GLAST含有显著更高百分比的星形胶质细胞。(D类)从E15到E18，在CAG、Nestin和GLAST条件下的GFP+星形胶质细胞与神经元的比值线图显示，GLAST中星形胶质细胞的富集程度最高（0.83±0.03），而Nestin（0.26±0.04）和CAG（0.39±0.02；n个=4-5个大脑，每个大脑5-6片；P（P）<0.0001，双向方差分析）。比例尺：A类=100μm（神经元）和50μm（星形胶质细胞）；和B类=20微米。
图6。
图6。
GLAST+群体产生更大的克隆相关星形胶质细胞簇。(A类)多色的示意图猪背肉系统。PBase的表达可以由感兴趣的启动子驱动，GFP/RFP/CFP由普遍存在的CAG启动子驱动。3种荧光蛋白的随机整合和不同表达导致了色腭。(B类)多色转染HEK293细胞猪背肉该系统产生了标记有不同颜色的大细胞簇。右侧的高倍图片显示了不同颜色簇的示例。(C类)GLAST或Nestin多色E16胚胎大鼠新皮质IUE猪背肉第21页收获。在这两种情况下都可以看到多色星形胶质细胞簇。(D类和E类)星形胶质细胞克隆簇大小的分布如条形图所示(D类)和馅饼(E类)图表。小的星形胶质细胞簇在Nestin+谱系中更为常见，而GLAST+谱系具有更大的簇，且具有更少的1-细胞星形胶质细胞克隆成分。双向方差分析显示所使用的启动子和星形胶质细胞簇百分比之间存在显著的相互作用(n个=138英寸Nestin-PBase，n个=316英寸GLAST-PBase，双向方差分析；P（P）< 0.0001).比例尺：B类=100μm（左）和20μm（右），C类=200微米。
图7。
图7。
Nestin+与GLAST+祖细胞从大鼠新皮质早期神经发生到胶质生成的谱系输出模型。Nestin+群体在神经元生成方面仍然受到限制，而GLAST+/Nestin++群体则多样化为神经元和星形细胞祖细胞的组合。两个启动子标记的早期E13群体在其整个谱系中都是神经原性的；然而，在中期神经发生过程中出现了一个高度星形胶质细胞生成的前体细胞。前体细胞在产生星形胶质细胞潜力方面的多样化始于神经发生中期，此时只有神经元作为直接子代产生（E15）。此外，GLAST+祖细胞群体产生的星形胶质细胞谱系在新皮质内具有更大的局部增殖能力，从而形成更大的克隆簇。
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参考文献

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