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。2012年11月13日；109（46）：E3186-95。
doi:10.1073/pnas.119964109。 Epub 2012年10月24日。

Ly-6C的差异表达确定了募集的巨噬细胞表型，这协调了小鼠肝纤维化的消退

普拉卡什·拉马钱德兰 1, 安东内拉·佩利科罗, 马德琳·A·弗农, 卢克·博尔特, 丽贝卡·奥科特, 艾莎·阿里, 史蒂芬·N·哈特兰, 维多利亚·K·斯诺登, 安德烈亚·卡彭, 蒂莫西·戈登·沃克, 迈克·J·威廉姆斯, 唐纳德·邓巴, 乔纳森·曼宁, 尼科·范·罗伊扬, 乔纳森·法洛菲尔德, 斯图亚特·福布斯, 约翰·P·伊雷代尔
附属公司

Ly-6C的差异表达确定了招募的巨噬细胞表型，该表型协调了小鼠肝纤维化的消退

普拉卡什·拉马钱德兰等人。 美国国家科学院程序。 。

摘要

尽管巨噬细胞被广泛认为在炎症中具有促纤维化作用，但我们已经使用了一种高度易处理的CCl（4）诱导的可逆性肝纤维化模型来识别和表征负责组织重塑的巨噬细胞表型：迄今为止难以捉摸的恢复性巨噬细胞。CD11B（hi）F4/80（int）Ly-6C（lo）巨噬细胞亚群在最大纤维化消退期间在肝脏中最为丰富，并代表主要基质金属蛋白酶（MMP）表达亚群。CD11B启动子-白喉毒素受体（CD11B-DTR）转基因小鼠中该群体的耗竭导致瘢痕重塑失败。过继转移和原位标记实验表明，这些恢复性巨噬细胞来源于招募的Ly-6C（hi）单核细胞，这是与纤维化前Ly-6C的巨噬细胞共同的来源，表明体内的表型转换具有促分辨特性。与Ly-6C（hi）巨噬细胞相比，Ly-6C亚群的微阵列分析显示M1/M2分类外的表型，MMPs、生长因子和吞噬相关基因的表达增加，包括Mmp9、Mmp12、胰岛素样生长因子1（Igf1）和糖蛋白（跨膜）nmb（Gpnmb）。共焦显微镜证实了恢复性巨噬细胞的吞噬后性质。此外，通过吞噬细胞碎片并激活ERK信号级联，在体外重现了恢复性巨噬细胞表型。至关重要的是，通过脂质体诱导体内吞噬行为，增加了恢复性巨噬细胞数量，加速了纤维化的消退，为这一孤儿病理过程提供了一种治疗策略。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
实验性肝纤维化显示出不同的纤维化发生和消退阶段。(A类)每周两次静脉注射4周的C57BL/6小鼠可逆性肝纤维化模型示意图4然后在最后注射后的连续时间点收获。与对照（未受伤）动物进行比较。(B类和C类)通过PSR、胶原蛋白1、胶原蛋白3和α-SMA免疫组织化学对肝纤维化和肌成纤维细胞激活的组织学特征。(B类)显示了控制动物和每个时间点的代表性图像。（比例尺：100μm）(C类)通过与对照动物平均面积百分比相关的形态像素分析量化组织学变化(n个=每个时间点4个；代表三个独立实验）。(D类)对照小鼠和最终CCI后规定时间点的血清ALT和AST水平4剂量(n个=两个独立实验的每个时间点5–6）。(E类)通过多重细胞因子分析测量的Il-1β、Ccl2、Ccl3和Cxcl2的全肝蛋白水平相对于24小时时间点的平均蛋白浓度表达(n个=两个独立实验的每个时间点7–9）。所有数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图2。
图2。
赖氨酸-6C低巨噬细胞在最大纤维化消退过程中占主导地位，是MMP表达的主要亚群。(A–G)最终CCl后24小时（炎症/纤维生成）、72小时（早期和最大瘢痕消退）和168小时（晚期消退）肝巨噬细胞的分析4注入。对对照（未受伤）小鼠进行比较。(A类)用流式细胞术测定相对于对照肝脏中巨噬细胞平均数的肝巨噬细胞总数(n个=两个独立实验的每个时间点8–12）。(B类)F4/80免疫组织化学显示，72小时时巨噬细胞定位于瘢痕周围（比例尺：100μm）(C类)80层/四层你好CD11B型整数损伤和消退期间的常驻库普弗细胞（代表性百分比表示F4/80你好川11B整数细胞占总巨噬细胞的比例）。(D类)CD11B的子集分析你好80层/四层整数单核细胞衍生的巨噬细胞根据Ly-6C的差异表达识别出两个不同的群体：Ly-6C你好和Ly-6C低随着损伤和消退过程中的动态变化（代表性百分比表示每个亚群占肝巨噬细胞总数的比例）。(E类)Ly-6C的定量你好，Ly-6C低和常驻巨噬细胞亚群占肝巨噬细胞总数的比例(n个=四个独立实验的每个时间点10–17）。(F类)每个时间点每个巨噬细胞亚群的每个肝脏相对数量相对于对照肝脏中平均总巨噬细胞数量的表达(n个=四个独立实验中每个时间点12–17）。(G公司和H（H）)CCl 4周后4小鼠分别在0和48小时给予荧光基质金属蛋白酶底物（MMPsense）或溶媒对照，24和72小时收获。(G公司)通过流式细胞术在24和72小时鉴定MMPsense阳性巨噬细胞。(H（H）)24和72小时MMPsense阳性巨噬细胞群的巨噬细胞亚群分析(n个= 3–4). 所有数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）< 0.001. 显示了具有代表性的流式细胞仪图、直方图和图像。
图3。
图3。
CD11B阳性巨噬细胞的耗竭定义Ly-6C低细胞对于疤痕的消退至关重要。(A类)通过给药DT（或PBS对照）在CD11B-DTR小鼠纤维化解决期间巨噬细胞耗竭模型的示意图。(B类)来自PBS和DT处理的小鼠肝脏的流式细胞术数据，这些小鼠在活CD45+Ly-6G−CD11B上门控你好80层/四层整数肝巨噬细胞（每个亚群的代表性百分比占所示巨噬细胞总数的比例）。(C类)PBS处理肝脏中每个巨噬细胞亚群相对数量相对于平均总巨噬细胞数量的定量(n个=11–13，来自两个独立实验）。(D类)巨噬细胞耗竭或控制后胶原1、胶原3和α-SMA的典型PSR染色和免疫组织化学。（比例尺：100μm）(E类)通过像素分析量化PBS治疗肝脏中相对于平均百分比面积的组织学变化(n个=10–12，来自两个独立实验）。(F类)PSR、胶原1和胶原3面积评估的纤维化程度与Ly-6C相对数量的相关性低巨噬细胞(n个=22，来自两个独立实验）。所有数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001. NS，无显著性。显示了代表性的流式细胞术图和图像。
图4。
图4。
赖氨酸-6C低肝巨噬细胞来源于招募的Ly-6C你好单核细胞。(A类)CD45.1+Ly-6C过继转移模型示意图你好最终CCl后4 h，单核细胞（或载体对照）进入C57BL/6小鼠（CD45.2+）4注射，在24、72和168小时收获肝脏(B类)在24和72小时的时间点鉴别消化肝脏中注射的CD45.1+细胞（对存活的CD45.2-细胞进行门控）。(C类)肝CD45.1+细胞主要分化为CD11B你好80层/四层整数单核细胞来源的巨噬细胞。(D类)CD45.1+单核细胞在很大程度上形成了恢复性Ly-6C低巨噬细胞亚群。(E类)确定形成每个巨噬细胞亚群的CD45.1+肝巨噬细胞比例的量化(n个=每个时间点3）。(F类)循环Ly-6C原位标记模型示意图低在最终CCl后4小时通过注射荧光乳胶珠（或载体对照）获得单核细胞4注入。(G公司)乳胶阳性巨噬细胞仅在168小时时在肝脏中被发现（通过活体CD45+Ly-6G−肝巨噬细胞进行门控）。(H（H）)乳胶阳性细胞已形成固有的CD11b整数80层/四层你好巨噬细胞数量。(我)在168小时时，形成每个肝巨噬细胞亚群的晚阳性细胞比例的量化（以晚阳性细胞的百分比表示；n个= 4). (J型和K（K）)K（K）我-67最终CCl后24、72和120小时肝巨噬细胞染色4受伤4周后服用。(J型)K（K）我-67–通过流式细胞术鉴定的阳性巨噬细胞。(K（K）)在指定时间点所述巨噬细胞亚群的百分比确定为K（K）我-67–阳性(n个= 3–6). 所有数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, ***P（P）< 0.001. 显示了具有代表性的流式细胞仪图和比例。
图5。
图5。
赖氨酸-6C低巨噬细胞表现出有利于瘢痕消退的基因表达谱。(A类和B类)炎症性Ly-6C的微阵列分析你好和恢复性Ly-6C低最终CCl后24和72小时通过FACS分类从肝脏中分离出的肝巨噬细胞群4分别注入。(A类)炎症和恢复性巨噬细胞群之间细胞因子、趋化因子、趋化因子受体、生长因子和基质降解酶的差异调节（表示为两个巨噬细胞亚群之间的倍数变化）。(B类)微阵列上巨噬细胞亚群之间调理蛋白、吞噬相关基因、PPAR-γ靶基因和巨噬细胞表型标记（M1，经典；M2，替代）的差异表达（表示为两个巨噬细胞群体之间的倍数变化）。所有微阵列数据基于n个=每组3个，取自两个独立实验*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. (C类)流式细胞术分析比较炎性Ly-6C的表达你好和恢复性Ly-6C低肝巨噬细胞。在收获前24小时给予MMPsense，以比较巨噬细胞亚群与炎症巨噬细胞亚群平均MFI表达的MMP活性(n个= 3–6). MFI，平均荧光强度*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (D类)24和72小时时小鼠肝脏和肝硬化人类肝脏微阵列上差异调节基因的免疫组织化学（所示为典型图像）。（比例尺：100μm）
图6。
图6。
恢复性Ly-6C低巨噬细胞为吞噬后细胞。炎症（24小时Ly-6C）的比较你好)和恢复性（72小时Ly-6C低)CCl 4周后巨噬细胞亚群4. (A类)通过流式细胞术评估巨噬细胞亚群的大小[正向散射面积（FSC-A）]和复杂性[侧面散射面积（SSC-A）(n个=13，来自三个独立实验）。(B类)F4/80免疫组织化学显示72小时时瘢痕相关巨噬细胞较大（比例尺：50μm）(C–E类)FACS分类亚群的TUNEL染色和共聚焦显微镜。(C类)染色的DAPI、TUNEL、F4/80和巨噬细胞亚群的合并图像。（比例尺：10μm）箭头、细胞表面碎片；箭头，摄入的碎片(D类)通过细胞计数与TUNEL阳性细胞核相关的每个亚群的百分比(n个= 3–4). (E类)TUNEL相关巨噬细胞与摄入或细胞表面碎片的百分比(n个= 3–4). 数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. NS，无显著性。显示了具有代表性的图像。
图7。
图7。
体外巨噬细胞吞噬通过ERK信号诱导基质降解表型。(A类和B类)骨髓基质干细胞与肝细胞碎片的共培养(A类)相控显微镜下巨噬细胞形态的变化。仅肝细胞碎片是不粘附的。(B类)共培养后巨噬细胞基因表达的变化相对于单巨噬细胞的平均表达(n个=11–12，来自两个独立实验）。(C类和D类)BMDM与凋亡胸腺细胞的共培养。(C类)与蛋白质含量相等的培养上清液明胶酶谱显示活性MMP-9（来自n个=4，来自两个独立实验）。(D类)蛋白质含量相等的培养上清液上MMP-12的Western blot（来自n个=4，来自两个独立实验）。(E类)最终CCl后72小时小鼠肝脏F4/80和磷酸化-ERK的双重免疫荧光4受伤4周后服用。箭头，核pERK和F4/80双阳性细胞。（比例尺：10μm）(F类和G公司). 培养BMDMs±MEK1/2抑制剂（PD98059；50μM）±肝细胞碎片(F类)共培养后巨噬细胞基因表达相对于单独巨噬细胞平均表达的变化(n个= 6). (G公司)培养上清液的酪蛋白酶谱与显示活性MMP-9和MMP-12的蛋白质含量相等（来自n个=3（如图所示）。数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001. 显示了具有代表性的图像。
图8。
图8。
使用脂质体诱导吞噬行为可增强体内恢复性巨噬细胞表型并加速纤维化的消退。(A类)体外喂食脂质体后巨噬细胞基因表达的变化（相对于未喂食巨噬细胞的平均表达）(n个= 6). (B类)CCl 4周后分辨阶段脂质体（或载体）给药模型示意图4受伤。(C类)脂质体给药后小鼠肝脏巨噬细胞亚群相对于平均总巨噬细胞数的变化(n个= 13–14). (D类)用流式细胞术评估每个含有荧光标记脂质体的肝巨噬细胞亚群的百分比(n个= 8). (E类)脂质体（或载体）给药后通过PSR染色评估纤维化。显示了具有代表性的图像。（比例尺：100μm）(F类)通过与脂质体治疗的肝脏平均面积百分比相关的形态计量像素分析定量纤维化(n个= 6). 数据显示为平均值±SEM*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图P1。
图P1。
纤维化消退过程中恢复性巨噬细胞的生成和作用。在纤维化过程中，炎性单核细胞被募集到炎症的肝脏中，形成Ly-6C你好纤维化前巨噬细胞。这些细胞在原位增殖并产生驱动炎症和纤维化反应的蛋白质。然后这些细胞吞噬细胞碎片，激活ERK信号级联并形成恢复性Ly-6C低巨噬细胞反过来表达介导纤维化消退的分子。脂质体治疗诱导吞噬行为，增加恢复性巨噬细胞的数量，并加速纤维化的消退。
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