Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions

doi:10.1038/nprot.2012.130

.2012年11月；7(11):2029-40.

doi:10.1038/nprot.2012.130。 Epub 2012年10月25日。

在化学定义的培养条件下，通过无酶分解实现人类多能干细胞的传代和菌落扩展

珍妮特·比尔斯¹, 丹尼尔·古尔布兰森, 妮可·乔治, 劳伦·西尼斯卡尔奇, 杰弗里·琼斯, 詹姆斯·汤姆森, 陈国凯

附属公司

PMID： 23099485
预防性维修识别码：项目经理3571618
DOI（操作界面）： 10.1038/nprot.2012.130

在化学定义的培养条件下，通过无酶分解实现人类多能干细胞的传代和菌落扩展

珍妮特·比尔斯等。 Nat协议. 2012年11月.

.2012年11月；7(11):2029-40.

doi:10.1038/nprot.2012.130。 Epub 2012年10月25日。

作者

珍妮特·比尔斯¹, 丹尼尔·古尔布兰森, 妮可·乔治, 劳伦·西尼斯卡尔奇, 杰弗里·琼斯, 詹姆斯·汤姆森, 陈国凯

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达国家心脏、肺和血液研究所（NHLBI）分子医学中心。

PMID： 23099485
预防性维修识别码：项目经理3571618
DOI（操作界面）： 10.1038/nprot.2012.130

摘要

本协议描述了一种基于EDTA的传代程序，该程序与化学定义的E8培养基一起使用，作为人类多能干细胞（PSC）基础和转化研究的工具。在该方案中，通过一个6孔或10厘米的细胞板大约需要6-7分钟。该无酶方案无需酶中和、离心或药物处理即可实现最大细胞存活率。它还允许更高的吞吐量，需要最少的材料，并限制污染。在这里，我们描述了如何为日常维护和重新编程生产一致的E8培养基，以及如何将基于EDTA的传代程序纳入人类诱导PSC（iPSC）衍生、菌落扩展、冷冻保存和畸胎瘤形成。该方案已成功用于常规细胞扩增，并能有效扩增大容量培养物或大量优先分离PSC的细胞。该程序对所有培养阶段都有效，为人类PSC在E8培养基中的传代提供了一致和通用的方法。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争性财务利益

J.A.T.是Cellular Dynamics International的创始人、股东、顾问和董事会成员。他还担任Tactics II干细胞风险投资公司的科学顾问，并在该公司拥有财务利益。

数字

**图1。EDTA解离是多能干细胞传代的有效方法**
a）通过不同方法总结细胞存活效率。解离后，酶/机械生成的大聚集体有效存活；个体化细胞在克隆密度下死亡，但在抑制剂或高负载密度下存活；EDTA生成的小聚集体通过高局部密度而有效存活，无需药物治疗。b）电镀后的人类ESC集落形态。H1细胞与EDTA部分分离，在几分钟内附着在平板上，在2小时内扩散，并作为菌落存活（24小时）。比例尺，50μm。c）比较不同传代方法的细胞存活率。细胞通过TrypLE、EDTA或Dispase分离并添加到Matrigel涂层板上；接下来，在24小时后对活细胞进行计数。星号（*）表示EDTA的存活率有显著差异(*P（P）*< 0.05,n个=3）在24小时时从TrypLE。

**图2。在化学定义的培养基中从人成纤维细胞衍生iPSC**
a）在基于EDTA/E8的iPSC衍生程序中，EDTA是大多数细胞培养阶段所需的主要处理方法。相比之下，传统程序使用多种分离方法（补充图4a）。b）本协议中所述步骤的简要总结。c） iPSC衍生过程中的细胞形态变化。比例尺，40μm。d）成纤维细胞衍生iPSCs多能性标记的FACS分析。细胞在规定的培养基中衍生，然后用EDTA法扩增。IgG控制：未填充峰值；FITC-结合抗体：绿色峰。抗体：OCT4-Alexa-488（Millipore，目录号FCMAB113A4）；SSEA4-FITC（生物传奇，目录号330410）；Tra1-60-FITC（Millipore，目录号FCMAB115F）；msIGg-FITC和非免疫控制（Millipore，目录号MABC006F）。e）来自成纤维细胞的iPSCs上多能性标记物的免疫染色。左，相位对比图像；右，荧光图像。比例尺，20μm。抗体：OCT4-Alexa-488（Millipore，目录号FCMAB113A4）；SSEA4-FITC（生物传奇，目录号330410）；Tra1-60-PE（Biolegend，目录号330610）。

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