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.2012年12月；32(24):5129-39.
doi:10.1128/MCB.01009-12。 Epub 2012年10月15日。

成人胰腺需要PERK，对维持葡萄糖稳态至关重要

闫高 1, 丹尼尔·J·萨托利, 李长虹, 钱春玉, 杰克·A·库什纳, M Celeste Simon先生, 艾伦·迪尔
附属公司

成人胰腺需要PERK，对维持葡萄糖稳态至关重要

闫高等。 分子细胞生物学. 2012年12月.

摘要

生殖系PERK突变与啮齿动物和人类的糖尿病和生长迟缓相关。相反，胚胎晚期切除PERK可促进胰岛发育，并可预防糖尿病的发生，这表明PERK在成人胰腺中可能是不必要的。为了明确确定PERK在成人胰腺中的功能作用，我们培育了携带条件PERK等位基因的小鼠，其切除受三苯氧胺的调节。无论是年轻成年还是成熟成年小鼠，PERK基因的缺失都会导致高血糖，并伴有胰岛和β细胞结构的丢失。PERK切除触发了胰岛素原和谷氨酰胺2的细胞内积累，大量内质网（ER）扩张，以及胰腺组织中特异性剩余未折叠蛋白反应（UPR）信号通路的代偿激活。尽管PERK切除增加了β细胞的死亡，但这并不是先前报道的增殖减少的结果。相反，观察到β细胞增殖显著且特异性增加，这反映了细胞周期蛋白D1积累增加。这项工作表明，与预期相反，PERK是成年小鼠分泌稳态和β细胞存活所必需的。

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数字

图1
图1
可诱导的PERK切除影响成年小鼠的葡萄糖稳态。（A） 实验设计示意图。8至12周或6个月大时，Cre-ERT2；PERK公司升/升和Cre-ERT2；PERK公司+/我小鼠经口灌胃给予TAM 5天，产生PERK基因敲除（PERK）Δ/Δ)和杂合子（PERK+/Δ)老鼠。PERK公司升/升和Cre-ERT2；PERKwt小鼠也接受了治疗。所有队列每5或7天测量一次随机喂养的血糖。（B） PERK胰腺裂解物的西方分析Δ/Δ，额外津贴+/Δ、PERK升/升和Cre-ERT2；TAM治疗1周后PERKwt小鼠和Cre-ERT2；PERK公司+/我（−TAM）使用抗PERK血清。（C） 照片一，PERK升/升（左）和Cre-ERT2；PERK公司升/升（右）（−TAM）小鼠8周龄，TAM治疗前；照片二，PERKΔ/Δ（左）和PERK升/升（右）8周龄TAM诱导PERK切除小鼠，TAM治疗后12至16周；照片三，PERK升/升（左）和PERKΔ/Δ（右）小鼠；照片四，PERK升/升（左）和PERK+/Δ（右）老鼠。对于照片III和IV，在6个月大时进行PERK切除，并在TAM治疗后12至16周评估体型。（D） TAM治疗后每5天测量一次血糖(n个=每种情况下5至8只小鼠；平均值±SEM）。*，P（P）< 0.05. （E） 葡萄糖耐量试验(n个=每种情况下5至7只小鼠；平均值±SEM）在TAM治疗后12周通过口服灌胃进行。*，P（P）<0.05（PERKΔ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt，PERK公司+/Δ和PERK升/升老鼠）。（F） GTT期间，在葡萄糖（Glu）输送后0分钟和15分钟对血液进行分泌胰岛素取样。*，P（P）<0.05（0分钟对15分钟）；#，P（P）<0.01（PERK+/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt和PERK升/升小鼠15分钟），平均值±SEM。
图2
图2
6个月大时切除PERK会在术后4周引发糖尿病。（A）珀克对6个月大的小鼠进行了急性切除。在最后一次TAM治疗后的第0天定期测量血糖(n个=每种情况下4至9只小鼠，平均值±SEM）。*，P（P）<0.01（PERKΔ/Δ小鼠与PERK+/Δ和PERK升/升老鼠）。（B） TAM治疗后10周处死小鼠，采集整个胰腺进行苏木精-伊红染色（40×）。（C） 从PERK收获的全胰脏Δ/Δ和对照组小鼠在TAM治疗16周后。（D） PERK中的TUNEL染色Δ/Δ和对照小鼠(n个=每种情况下4至5只小鼠，平均值±SEM）。*，P（P）<0.05（PERKΔ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt，PERK公司+/Δ和PERK升/升老鼠）。（E） 在TAM治疗后3周处死小鼠之前，连续给小鼠饮用含有BrdU（1 mg/ml）的饮用水1周。**，P（P）< 0.01 (n个=每种情况下4至5只小鼠，平均值±SEM）。
图3
图3
8周龄时切除PERK会触发β细胞死亡。（A） PERK的胰腺切片Δ/ΔTAM治疗后12至16周，对照组小鼠用苏木精-伊红（40×）染色。（B） 在TAM治疗12至16周后，从小鼠中分离出整个胰腺，并称重(n个=每种情况下4至9只小鼠；平均值±SEM）。胰腺与体重的比值已确定。*，P（P）<0.01（PERKΔ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt和PERK升/升接受或不接受TAM治疗的小鼠）。（C） 来自PERK的β细胞（图像a到e）或腺泡细胞（图像f到h）的电子显微照片升/升和PERKΔ/ΔTAM治疗后12周的小鼠。N、 核；内质网；SG，分泌颗粒；AV，自噬小泡(n个=每种情况下3只小鼠）。水平条对应于500 nm。
图4
图4
8周龄小鼠的PERK切除会触发β细胞ER中胰岛素原和Glut2的异常积聚。（A）最上面一行显示PERK中Glut2（红色）的代表性免疫荧光染色升/升或PERKΔ/ΔTAM治疗3周后β细胞；最下面一行提供了β细胞中胰岛素原（绿色）和谷氨酰胺（红色）的典型免疫荧光染色。（B） 从PERK分离的胰岛中测量细胞浆钙升/升（蓝色）和PERKΔ/ΔTAM治疗后1周（i和ii）、2周（iii）或3-5周（iv）时的（红色）小鼠。从每种基因型的1或2只小鼠中分离出原代胰岛，并从每个基因型中随机选择12个胰岛用于本实验。基底[Ca2+]我观察葡萄糖（G；5、10和25 mM）逐步刺激的水平和反应。彩色实线表示平均值，垂直灰色线表示SEM。*，P（P）<0.01（PERKΔ/Δ小鼠与PERK升/升老鼠）。
图5
图5
年轻成年小鼠中β细胞特异性PERK基因敲除导致快速出现高血糖。（A） 实验设计示意图。（B） Pdx1-Cre小鼠在8周龄时接受TAM治疗。在TAM治疗5天后，对分离的原代胰岛或腺泡进行PERK切除PCR。（C） 血糖浓度的时间进程(n个=每种情况下4至8只小鼠，平均值±SEM；P（P）< 0.01). （D） TAM治疗后9周处死所有小鼠，并分析整个胰腺。胰腺切片用苏木精-伊红染色并拍照（40×）。
图6
图6
8周龄时切除PERK可诱导β细胞凋亡和增殖。（A） TAM治疗后3周，采用TUNEL评估β细胞死亡。箭头表示TUNEL（红色）、胰岛素（绿色）和DAPI三重阳性细胞。该图表示TUNEL阳性和胰岛素阳性细胞的定量(n个=每种情况下4至6只小鼠；平均值±SEM）。*，P（P）<0.01（PERKΔ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt、PERK+/Δ和PERK升/升老鼠）。（B和C）小鼠在治疗前1周连续饮用饮用水中的BrdU，在TAM治疗后3周处死（B）(n个=每种情况下5只小鼠；平均值±SEM）或治疗前2周和治疗后12周处死（C）(n个=每种情况下3至6只小鼠；平均值±SEM）。**，P（P）<0.01（PERKΔ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt、PERK+/Δ和PERK升/升老鼠）.*，P（P）<0.05（PERKΔ/Δ小鼠对Cre-ERT2；PERKwt和PERK升/升接受或不接受TAM治疗的小鼠）。绿色，胰岛素；红色，BrdU。（D） TAM治疗后3周取小鼠石蜡包埋胰腺切片，用抗细胞周期蛋白D1抗体进行免疫染色。箭头表示细胞周期蛋白D1、胰岛素和DAPI三重阳性细胞或细胞周期蛋白D2和胰岛素双阳性细胞。绿色，胰岛素；红色，cyclin D1。
图7
图7
8周龄时PERK基因敲除胰岛Ire和ATF6的激活。从PERK分离出原代胰岛升/升和PERKΔ/Δ三苯氧胺治疗后1～2周。蛋白质印迹（A）或qPCR(n个=9，平均值±SEM）（B）用于评估Ire和ATF6或其下游效应器的激活情况。用thapsigargin治疗T细胞淋巴瘤6814 16 h，作为阳性对照。ATF6、sXBP1和cyclin D1印迹使用相同的负载控制。*，P（P）<0.05（PERKΔ/Δ小鼠与PERK升/升老鼠）。（C） TAM治疗后3周，采用TUNEL评估β细胞死亡。从TAM给药开始，小鼠每天接受一次胰岛素（5 IU/kg或10 IU/kg/kg）或PBS。绿色，胰岛素；红色，TUNEL。箭头表示TUNEL、胰岛素（insulin）和DAPI三重阳性细胞。该图表示TUNEL阳性和胰岛素阳性细胞的定量(n个=4至6，平均值±SEM）。*，P（P）<0.01（PERKΔ/Δ小鼠[ins，5IU/kg或10IU/kg]与PERKΔ/Δ小鼠[PBS]）。#，P（P）<0.01（PERKΔ/Δ小鼠[ins，5IU/kg或10IU/kg]与PERK升/升小鼠[PBS或ins]）。
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