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。2012年10月16日；109(42):17087-92.
doi:10.1073/pnas.1205271109。 Epub 2012年10月1日。

Mecp2突变小鼠海马神经元中活性依赖性BDNF释放和TRPC信号受损

魏丽 1, 加斯顿·卡尔法, 詹妮弗·拉里莫尔, 卢卡斯·波佐·米勒
附属公司

Mecp2突变小鼠海马神经元中活性依赖性BDNF释放和TRPC信号受损

魏丽等。 美国国家科学院程序。 。

摘要

神经营养素脑源性神经营养因子（BDNF）的功能障碍与Rett综合征（RTT）有关，但其可释放池和缺乏甲基-CpG-结合蛋白-2（Mecp2）的小鼠下游信号的状态尚不清楚。在这里，我们发现由重组BDNF或二酰甘油（DAG）敏感的瞬态受体电位典型（TRPC）通道激活物诱发的膜电流和树突状Ca（2+）信号在症状性Mecp2突变小鼠的CA3锥体神经元中受损。在Mecp2突变的海马中，TRPC3和TRPC6的mRNA和蛋白水平较低，染色质免疫沉淀（ChIP）将TRPC3鉴定为Mecp2转录调控的靶点。Mecp2突变的海马和齿状回颗粒细胞中BDNF mRNA和蛋白水平也较低，这反映在根据TRPC电流和CA3锥体神经元树突状Ca（2+）信号估计的内源性BDNF活性依赖性释放受损。这些结果确定了编码TRPC3通道的基因作为MeCP2靶点，并建议了一种潜在的治疗策略，以增强RTT中受损的BDNF信号。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
膜电流和Ca2+在有症状的男性中，由重组BDNF和TRPC3/6通道激活剂诱发的信号受损机械2突变小鼠。(A类)以下方面的典型示例我BDNF公司在500 nM TTX存在下，将重组BDNF单次30秒应用于CA3锥体神经元顶树突诱发(SI材料和方法). (B类)峰值我BDNF公司振幅较小机械2−/年神经元。(C类)以下方面的典型示例我BDNF公司和同时存在的树枝状钙2+在500 nM TTX存在下CA3锥体神经元中诱发的信号（图像是加载fura-2并在380 nM激发的神经元；比例尺：10μm；R是fura-2发射的360/380-nM比率）。(D类)fura-2 360/380比值变化（δ）与峰值之间的相关性我BDNF公司野生型振幅（灰色圆圈）和机械2−/年神经元（灰色开放圆圈）。fura-2 360/380比值和峰值的平均变化我BDNF公司振幅较小机械2−/年神经元（暗开环）比野生型神经元（暗填充环）多。(E类)电流的典型示例(我小狗)和钙2+在500 nM TTX存在下，DOG对CA3锥体神经元顶端树突单次30秒应用诱发的信号（图像为加载呋喃-2并在380 nM激发的神经元；比例尺：10μm）。(F类)fura-2 360/380比值变化与峰值的相关性我小狗野生型振幅（灰色填充圆圈）和机械2−/年神经元（灰色开放圆圈）。fura-2 360/380比值和峰值的平均变化我小狗振幅较小机械2−/年神经元（暗开环）比野生型神经元（暗填充环）多。本图和下图中的所有数据均为平均值±SEM*P（P）<0.05野生型vs。机械2−/年。
图2。
图2。
BDNF、TRPC3和TRPC6在有症状男性的几个脑区的表达受损机械2突变小鼠。(A类–C类)野生型和非野生型海马样本中Western免疫印迹的代表性示例机械2−/年评估BDNF(A类)，TRPC3(B类)和TRPC6(C类)蛋白质水平。(A类)在不同浓度的重组成熟met-BDNF样品中进行免疫印迹(左侧)，在来自野生型和机械2−/年老鼠(居中)和使用重组BDNF预吸收的一级抗体在海马裂解物中(赖特). 定量分析结果（使用α-微管蛋白作为负荷控制）和印迹右侧显示的结果表明BDNF较低(A类)，TRPC3(B类)和TRPC6(C类)海马中的水平机械2−/年小鼠（BDNF，n个=10只小鼠，P（P）< 0.0001; TRPC3、，n个=8只小鼠，P（P）< 0.0001; TRPC6、，n个=7只小鼠，P（P）= 0.018; 双尾非配对吨测试）。(D–F型)实时RT-PCR分析显示Bdnf公司,三氯二苯甲烷、和Trpc6号机组海马mRNA水平机械2−/年老鼠(Bdnf公司,n个=8只小鼠，P（P）= 0.045;三氯二苯甲烷,n个=8只小鼠，P（P）=0.0074；Trpc6号机组,n个=8只小鼠，P（P）= 0.0025; 双尾非配对吨测试）。(G公司,左侧)CA3中耳MF道BDNF免疫反应的半定量分析透明层. (赖特)BDNF和突触素的代表性例子(插入)野生型海马CA3区IHC(上部)和机械2突变体(下部)老鼠。需要注意的是，突触素免疫反应强度在基因型之间具有可比性（比例尺：10μm）。(H（H）,左侧)ChIP后琼脂糖凝胶电泳的典型例子表明MeCP2和三氯二苯甲烷野生型小鼠样品中的基因，其在对照IgG和机械2突变体。(赖特)在转录起始位点上游0.2–4.4 kb的MeCP2占位映射三氯二苯甲烷基因*P（P）<0.05，野生型vs。机械2−/年。
图3。
图3。
膜电流和Ca2+有症状的男性突触前MFs刺激诱发的信号受损机械2突变小鼠。(A类)代表MF-我BDNF公司野生型和机械2−/年谷氨酸能和γ-氨基丁酸能受体拮抗剂混合物存在时传入MF的TBS诱发的小鼠(SI材料和方法). (B类)MF的输入输出曲线-我BDNF公司. (C类)同时记录全细胞和钙离子时呋喃-2负载神经元的代表性图像2+成像（380 nm激发；比例尺：10μm；R是360/380-nm呋喃-2比率）。Fura-2 360/380比值是从一级树突上的感兴趣区域（ROI）测量的（右侧痕迹中的彩色编码）；虚线方框是背景测量的ROI。(D类)峰值MF-我BDNF公司fura-2360/380比值的振幅和变化与传入刺激强度的关系图。(E类)较低级别Bdnf公司个体mRNA机械2−/年齿状回颗粒细胞（单细胞实时RT-PCR），在MF诱导的CA3锥体神经元突触前我BDNF公司（中频-我BDNF公司). *P（P）<0.05，野生型vs。机械2−/年。
图4。
图4。
CA3中TrkB受体的激活透明层有症状的男性MF刺激后受损机械2突变小鼠。(左侧)CA3急性切片在三组TBS治疗前（对照）和治疗后用抗磷酸化TrkB受体抗体进行免疫组化标记的典型例子透明层野生型(上部)和机械2突变小鼠(下部). (赖特)磷酸化TrkB免疫反应的半定量分析。刺激后磷酸化TrkB IHC染色强度在机械2尽管与相应基因型的原始对照组相比，突变切片比野生切片增加。与BDNF清除剂TrkB-IgG（1μg/mL）预孵育完全消除了TBS后磷酸化TrkB免疫反应性的增加机械2−/年切片(右下角). 插图显示了相应部分的放大倍数较高的图像。服务提供商，金字塔层; SL、，透明层; 所以，地层oriens（比例尺：10μm）*P（P）<0.05。
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