Small molecule activation of PKM2 in cancer cells induces serine auxotrophy

doi:10.1016/j.chembiol.2012.07.021

.2012年9月21日；19(9):1187-98.

doi:10.1016/j.chembiol.2012.07.021。

癌细胞PKM2小分子激活诱导丝氨酸营养不良

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PMID： 22999886
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DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.chembiol.2012.07.021

癌细胞PKM2小分子激活诱导丝氨酸营养不良

查尔斯·孔等。化学生物. 2012.

.2012年9月21日；19(9):1187-98.

doi:10.1016/j.chembiol.2012.07.021。

附属

¹Agios Pharmaceuticals，38 Sidney Street，Cambridge，MA 02139，USA（美国马萨诸塞州剑桥市西德尼街38号）。

PMID： 22999886
预防性维修识别码：项目经理3775715
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.chembiol.2012.07.021

摘要

增殖的肿瘤细胞利用有氧糖酵解来支持其高代谢需求。自相矛盾的是，糖酵解增加往往伴随着活性较低的PKM2亚型的表达，有效地抑制了糖酵分解的降低。在这里，我们报道了具有独特变构结合模式的PKM2激活子的发现。这些化合物如何影响癌细胞的特征揭示了葡萄糖和氨基酸代谢之间意外的联系。PKM2的激活导致癌细胞的代谢重组，表现为对非必需氨基酸丝氨酸的高度依赖，以使细胞持续增殖。PKM2激活诱导丝氨酸营养不良伴随着进入丝氨酸生物合成途径的碳流量减少和高亲和力丝氨酸转运体表达增加。这些数据支持这样一种假设，即PKM2的表达赋予癌细胞代谢灵活性，使其能够适应营养应激。

PubMed免责声明

数字

**图1。化合物14以独特的结合方式与PKM2结合**
（A）化合物的X射线络合物结构14在PKM2四聚体的界面中，其中红色球体表示配体。晶体结构统计如图S1A所示。（B）化合物的结合方式14（右）与**NIH-10**（左）（PDB:3GR4），杆中有Phe26残留。化合物的电子密度省略图14如图S1B所示。

**图2。PKM2激活剂的生化特性**
（A） Cpd的生化活性测定9、Cpd15和FBP对抗重组PKM2。本试验中检测到的PKM2激活范围始终为6倍。（B）在添加9或FBP（30分钟），然后评估丙酮酸激酶活性。（C）如（B）所示，除了PKM2在添加9或FBP。图S2显示了显示丝氨酸相同实验结果的补充数据。（D）含有强力霉素诱导发夹靶向PKM2的A549细胞在强力霉素（DOX）存在或不存在的情况下生长，然后用9或15如实验程序所述，对细胞进行PKM2活性或PKM2蛋白水平的裂解和分析。（E）重组PKM2与9在指定浓度下保持30分钟。为了测量失活率，PKM2与10×AC孵育₅₀在100倍稀释至分析缓冲液之前。如实验程序中所述，通过测量NADH消耗来连续监测反应速率。（F） A549细胞用A549细胞处理90分钟9在取出培养基之前（时间0），用培养基清洗细胞两次，然后用培养基重新培养。如图1D所示，在化合物洗脱后的不同时间点评估PKM2活性。误差条代表SD。

**图3。PKM2活化减少丝氨酸途径碳流**
（A）散点图显示用0.5 uM处理24小时的A549细胞中的代谢物水平9或DMSO。如实验程序所述，通过高通量飞行时间质谱法提取和分析细胞代谢物。（B）通过靶向LC/MS分析用DMSO或0.5μM处理的A549细胞的选定代谢物924小时。绘制的比率表示三个独立实验的平均值。R5p，核酮糖-5-磷酸；PEP，磷酸烯醇丙酮酸，3-PG=3-磷酸甘油酯。（C）左：显示转换的示意图¹⁵N-谷氨酰胺¹⁵N丝氨酸通过内源丝氨酸生物合成途径酶PSAT1的作用。正确的：¹⁵用二甲基亚砜或924小时。误差条代表SD。另请参见图S3。

**图4。PKM2激活调节丝氨酸途径代谢和转运相关基因的表达**
（A） DMSO或DMSO处理后选定丝氨酸代谢基因的转录变化1624小时PHP，磷酸羟基丙酮酸；PS，磷丝氨酸。除标有星号的差异外，所有成对差异均显著（调整后的p值<0.05）（调整后p值=0.11）。另请参见图S4B。（B）用二甲基亚砜或化合物处理48小时的A549细胞的蛋白质印迹9.（C）化合物诱导的转录变化16在ATF4靶基因中。右侧显示了选定基因的转录水平增加，如（A）所示。误差条代表SD。

**图5。PKM2激活诱导丝氨酸营养不良**
（A） A549细胞接种96-well板过夜，然后用9（1uM）在RPMI或BME培养基中培养72小时。数据标准化为添加化合物时的ATP水平（T0）。（B）评估化合物的IC₅₀对照BME培养基中生长的A549细胞，如（A）所示（绘制在x轴上），以及其AC₅₀在A549细胞中PKM2激活，如图2D所示（绘制在y轴上）。线性回归得出相关系数（R²)0.93。（C） A549细胞经9（1 uM）在BME培养基或在100 uM添加单一氨基酸的BME培养液中培养72小时。（D）用9（1 uM）在BME培养基或BME+NEAA培养基中培养72小时，缺乏所示的每个氨基酸。（E） A549细胞经9（1uM）在缺乏第二个单独氨基酸的BME+NEAA丝氨酸培养基或BME+NEAA丝氨酸培养基中培养72小时。（−S，−丝氨酸）（F）A549细胞经9（1 uM）在BME培养基中培养72小时，并在指定浓度下添加丝氨酸。（G）¹⁵24小时后在A549细胞中检测到N丝氨酸（黑色条）或总丝氨酸（灰色条）水平，有或没有丝氨酸提取或PKM2激活。细胞被标记为¹⁵N-谷氨酰胺如图3C所示。（H） 24小时后丝氨酸代谢基因的表达，有无丝氨酸戒断或复合物激活PKM216（I）用DMSO或化合物处理48小时的A549细胞的蛋白质印迹9有或没有丝氨酸退出。误差条代表SD。另请参见图S5。

**图6。PKM2激活与丝氨酸剥夺联合诱导细胞凋亡**
显示PKM2激活和丝氨酸剥夺所实现的细胞抑制效应的模型。Cpd公司9处理导致通过内源性丝氨酸生物合成途径的流量减少，丝氨酸转运体水平增加（左下）。丝氨酸缺乏导致通过丝氨酸生物合成途径的流量增加（右上角）。同时激活PKM2和丝氨酸剥夺导致细胞增殖受阻（右下）。

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中的注释

癌症代谢的小分子重编程。
普拉特先生。普拉特先生。化学生物。2012年9月21日；19(9):1084-5. doi:10.1016/j.chembiol.2012.09.001。化学生物。2012 PMID：22999876

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1. Boxer MB、Jiang J、Vander Heiden MG、Shen M、Veith H、Cantley LC、Thomas CJ。美国国立卫生研究院分子图书馆项目的探针报告。医学博士贝塞斯达：国家生物技术信息中心；2010年a。人类丙酮酸激酶第3版M2亚型激活剂的鉴定。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK56225/-公共医学
1. Boxer MB、Jiang JK、Vander Heiden MG、Shen M、Skoumbourdis AP、Southall N、Veith H、Leister W、Austin CP、Park HW等。取代N，N'-二芳基磺酰胺类药物作为肿瘤细胞特异性丙酮酸激酶M2亚型激活剂的评估。医学化学杂志。2010年b；53:1048–1055.-项目管理咨询公司-公共医学
1. Christof k HR、Vander Heiden MG、Harris MH、Ramanathan A、Gerszen RE、Wei R、Fleming MD、Schreiber SL、Cantley LC。丙酮酸激酶M2剪接亚型对癌症代谢和肿瘤生长很重要。自然。2008年a；452:230–233.-公共医学

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[4] Ashizawa K，Willingham MC，Liang CM，Cheng SY.葡萄糖对丙酮酸激酶M2亚型单体四聚体转化的体内调节是通过1,6-二磷酸果糖介导的。生物化学杂志。1991;266:16842–16846.-公共医学

[5] Boxer MB、Jiang J、Vander Heiden MG、Shen M、Veith H、Cantley LC、Thomas CJ。美国国立卫生研究院分子图书馆项目的探针报告。医学博士贝塞斯达：国家生物技术信息中心；2010年a。人类丙酮酸激酶第3版M2亚型激活剂的鉴定。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK56225/-公共医学

[6] Boxer MB、Jiang J、Vander Heiden MG、Shen M、Veith H、Cantley LC、Thomas CJ。美国国立卫生研究院分子图书馆项目的探针报告。医学博士贝塞斯达：国家生物技术信息中心；2010年a。人类丙酮酸激酶第3版M2亚型激活剂的鉴定。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK56225/-公共医学

[7] Boxer MB、Jiang JK、Vander Heiden MG、Shen M、Skoumbourdis AP、Southall N、Veith H、Leister W、Austin CP、Park HW等。取代N，N'-二芳基磺酰胺类药物作为肿瘤细胞特异性丙酮酸激酶M2亚型激活剂的评估。医学化学杂志。2010年b；53:1048–1055.-项目管理咨询公司-公共医学

[8] Boxer MB、Jiang JK、Vander Heiden MG、Shen M、Skoumbourdis AP、Southall N、Veith H、Leister W、Austin CP、Park HW等。取代N，N'-二芳基磺酰胺类药物作为肿瘤细胞特异性丙酮酸激酶M2亚型激活剂的评估。医学化学杂志。2010年b；53:1048–1055.-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Christof k HR、Vander Heiden MG、Harris MH、Ramanathan A、Gerszen RE、Wei R、Fleming MD、Schreiber SL、Cantley LC。丙酮酸激酶M2剪接亚型对癌症代谢和肿瘤生长很重要。自然。2008年a；452:230–233.-公共医学

[10] Christof k HR、Vander Heiden MG、Harris MH、Ramanathan A、Gerszen RE、Wei R、Fleming MD、Schreiber SL、Cantley LC。丙酮酸激酶M2剪接亚型对癌症代谢和肿瘤生长很重要。自然。2008年a；452:230–233.-公共医学

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