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.2012年9月15日；26(18):2009-14.
doi:10.1101/gad.197640.112。

TAp73缺失通过代谢失调加速衰老

亚历山德罗·鲁菲尼 1, 玛丽亚·维多利亚·尼基森·奇鲁, 井上佐治, 理查德·托马西尼, 艾萨克·S·哈里斯, 阿里安娜·马里诺, 马西莫·费德里奇, 大卫·丁斯代尔, 理查德·奈特, 格里·梅利诺, 麦德华
附属公司

TAp73缺失通过代谢失调加速衰老

亚历山德罗·鲁菲尼等。 基因开发. .

摘要

衰老与活性氧（ROS）清除受损有关。在这里，我们证明了TAp73，一个p53家族成员，通过调节线粒体活性和防止活性氧的积累来防止衰老。TAp73-null小鼠表现出更明显的衰老，氧化损伤和衰老增加。TAp73缺失降低了细胞ATP水平、耗氧量和线粒体复合物IV活性，同时增加了ROS的产生和氧化应激敏感性。我们证明线粒体复合体IV亚单位细胞色素C氧化酶亚单位4（Cox4i1）是TAp73的直接靶点，Cox4i 1敲除现象复制了TAp73完整细胞的细胞衰老。结果表明，TAp73影响线粒体呼吸和ROS稳态，从而调节衰老。

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数字

图1。
图1。
TAp73缺失加速衰老。(A类)影响TAp73基因敲除（KO）动物体重减轻(n个= 8). 平均值±标准偏差(B类)用Lunar PIXImus密度计测量体脂百分比(n个= 8). 平均值±标准偏差(C类)射线照相显示18个月龄TAp73基因敲除小鼠的脊柱后凸增强。(D类)用Western blot检测老年动物器官提取物中p16的水平。采用Tubulin作为负荷控制。(E类,顶部)18个月龄野生型（WT）和TAp73基因敲除小鼠指示器官中羰基化蛋白的水平。(底部)器官提取物考马斯染色显示负载均匀。(F类)与野生型对照相比，晚传代（P8）TAp73敲除MEF的增殖能力降低。(G公司)SA-β-Gal阳性衰老MEF的量化。平均值±标准偏差(H（H）)衰老标志物p16和p19的蛋白质印迹农业研究基金在后期（P8）MEF中。采用Tubulin作为负荷控制。
图2。
图2。
TAp73敲除早期传代MEF中线粒体功能降低和活性氧失衡。(A类)野生型（WT）和TAp73敲除型（KO）MEF（p2）未经治疗（CTRL）或用0.5 mM H激发2哦2（H）2哦2)PI染色和流式细胞仪检测细胞死亡。平均值±标准偏差(B类)野生型和TAp73敲除的MEF在20%和3%氧气浓度下生长。细胞数量表示为野生型对照的折叠。平均值±标准偏差(C类)用载体（CTRL）或30μM Trolox/30μM抗坏血酸抗氧化混合物（AO）处理野生型和TAp73敲除型MEF。细胞在计数前生长72小时。细胞数量表示为野生型对照的折叠。平均值±标准偏差(D类)ROS荧光团DCFDA对TAp73敲除的MEFs的染色增加。(E类)野生型和TAp73敲除型MEF的状态III耗氧量。用Oroboros血氧饱和度仪测量耗氧量，并将其归一化为细胞数。状态III是通过添加ADP诱导的。(F类)用MEF测量NADH水平，并将其归一化为蛋白质含量。平均值±标准偏差(G公司)减少野生型和TAp73基因敲除小鼠肺部和肾脏的耗氧量。数据以野生型对照的百分比表示(n个= 3). (H（H）)线粒体O的测量2−与MitoSox Red在野生型和淘汰型MEF中的水平相同。(我)MEF中的ATP水平标准化为蛋白质含量，并表示为野生型对照的百分比。(J型)用指定剂量的2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）处理的野生型和敲除型MEF通过台盼蓝排斥法检测存活率。平均值±标准偏差。
图3。
图3。
HCT116细胞中TAp73的敲除重述了小鼠的表型。(A类)Western blot分析显示TAp73敲除的效率。用siRNA对照（scr）和抗TAp73的siRNA（siTAp73）处理细胞，并在转染后72小时进行评估。(B类)用siRNA控制（scr）和抗TAp73（sip73）的siRNA处理的细胞未经处理（CTRL）或用0.2 mM H激发2哦2持续8小时（h2哦2)PI染色和流式细胞仪检测细胞死亡。平均值±标准偏差(C类)使用DCFDA分析siRNA处理的细胞。TAp73缺失细胞染色增强。(D类)线粒体O分析2−TAp73缺失HCT116中选择性染料MitoSox红的水平。(E类)用siRNA控制或靶向TAp73的siRNA处理的细胞的状态III耗氧量。用Oroboros血氧饱和度仪测量耗氧量，并将其归一化为细胞数。通过注射ADP诱导状态III。平均值±标准偏差(F类)细胞的基础呼吸E类平均值±标准偏差(G公司)用siRNA控制或靶向TAp73的siRNA处理的细胞中ETC复合物IV的活性。
图4。
图4。
TAp73缺乏对高热量摄入期间葡萄糖耐量的影响。(A类)与ND相比，经HFD治疗16周后，TAp73敲除（KO）小鼠体重增加减少，胰岛素敏感性和糖耐量改善。(B类)TAp73敲除小鼠的VO降低2、VCO2和HFD治疗16周后的呼吸交换比（RER）。(n个=每组6人）。平均值±标准偏差（**）P（P）< 0.01.
图5。
图5。
Cox4i1是一个TAp73靶基因。(A类)野生型（WT）和TAp73敲除（KO）MEF中Cox4i1转录物的定量PCR归一化为内源性肌动蛋白。(B类)相同细胞中Cox4i1的蛋白质水平。Tubulin被用作负荷控制。(C类)用siRNA控制或靶向TAp73的siRNA处理HCT116细胞中的Cox4i1蛋白。(D类)6月龄野生型和TAp73基因敲除小鼠肺和肾提取物中Cox4i1蛋白降低。(E类)ChIP对HA-taged TAp73 Tet-inducible SaOs-2进行检测，显示在Cox4i1的第一内含子中TAp73与p53RE直接结合。HDM2作为阳性对照。(F类)荧光素酶分析显示，由Cox4i1的400-bp第一内含子片段驱动的TAp73介导荧光素酶活性上调。使用含有p21RE的荧光素酶载体作为阳性对照。(G公司)用siRNA对照或两种靶向Cox4i1的独立siRNA处理的HCT116细胞中的状态III耗氧量。平均值±标准偏差(H（H）)O的MitoSox红染色2−HCT116中按G公司. (我)HCT116细胞按G公司被H挑战2哦2PI染色检测细胞死亡。平均值±标准偏差(J型)用两种不同的抗Cox4i1的shRNAs（sh1和sh2）或打乱控制（scr）处理野生型MEF，以评估其在传代后期（P7）衰老标记的表达。报告规范化的表达式级别在下面相对斑点。(K（K）)用空载体或表达标记小鼠Cox4i1的质粒转染36 h的野生型和敲除型MEF（P3）中的状态III耗氧量。通过注射ADP诱导状态III。用抗Flag抗体检测外源性Cox4i1的表达。
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中的注释

  • p53家族变老了。
    Flores ER、Lozano G。 Flores ER等人。 基因开发2012年9月15日；26(18):1997-2000. doi:10.1101/gad.202648.112。 基因开发，2012年。 PMID：22987633 免费PMC文章。

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