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.2012年11月；53(11):1887-97.
doi:10.1111/j.1528-1167.2012.03666.x。 Epub 2012年9月17日。

在无伴随病理学的情况下，大鼠大脑暴露于血清白蛋白在体内诱导的长期促杀作用

费德里卡·弗里吉里奥 1, 安吉莉莎·弗雷斯卡, 伊泰·魏斯伯格, 萨拉·帕雷拉, 阿隆·弗里德曼, 安娜玛丽亚·维萨尼, 弗朗西斯科·莫诺
附属公司

在无伴随病理学的情况下，大鼠大脑暴露于血清白蛋白在体内诱导的长期促杀作用

费德里卡·弗里吉里奥等。 癫痫. 2012年11月.

摘要

目的：血脑屏障功能障碍（BBB）是癫痫发作或致痫性脑损伤后常见的现象，实验诱导的血脑屏障开放可促进幼稚动物和癫痫动物的癫痫发作。据报道，脑白蛋白外渗可通过诱导星形胶质细胞功能障碍来促进过度兴奋。为了提供体内证据，证明渗出的血清白蛋白在癫痫发作中的直接作用独立于病理背景，我们做了以下工作：（1）量化癫痫持续状态（SE）期间大鼠脑实质渗出的血浆白蛋白量；（2） 通过侧脑室注射白蛋白在幼年大鼠海马中产生类似浓度；（3） 测量这些大鼠的脑电图（EEG）活性、对红藻氨酸（KA）诱导的癫痫的敏感性以及海马后放电阈值（ADT）。

方法：采用western blot分析法测定SE后2和24小时大鼠海马和其他前脑区域的脑白蛋白浓度。分别用免疫组织化学和免疫荧光法研究血清白蛋白或异硫氰酸荧光素（FITC）-白蛋白在脑内的分布。给幼稚大鼠静脉注射大鼠白蛋白或FITC-白蛋白，以模拟SE后达到的大脑浓度，或使用右旋糖酐作为对照。通过免疫组织化学检测白细胞介素（IL）-1β的胶质诱导来评估炎症。Western blot分析检测海马内向整流钾通道亚基Kir4.1蛋白水平。海马内注射80 ng KA诱导大鼠癫痫发作，并在大鼠白蛋白或右旋糖酐给药后2或24 h通过脑电图分析进行量化。白蛋白注射3个月后，通过电刺激海马测定ADT。在这些大鼠中，连续监测脑电图2周，以寻找自发发作。

主要发现：SE后24 h海马血清白蛋白浓度为0.76±0.21μm。在其他前脑区域也检测到类似的浓度，而在小脑中没有发现变化。通过静脉注射500μg/4μl大鼠白蛋白，幼年大鼠的海马白蛋白浓度也得到了类似的复制：白蛋白主要在注射后2小时在细胞外检测到，而在24小时时，在锥体神经元内可见，只有少数分散的硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）阳性细胞中可见，但在胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性星形胶质细胞或CR-3补体受体（OX-42）阳性小胶质细胞中不存在。幼年大鼠海马中白蛋白的存在与GFAP阳性星形胶质细胞中诱导的IL-1β和伴随的Kir4.1组织下调有关。持续2小时的海马中的白蛋白可诱发峰值活动。当在白蛋白注射后2小时或24小时将KA置于海马内时，3小时EEG记录中的总发作间期峰值数量平均显著增加两倍。注射白蛋白三个月后，脑组织中未检测到白蛋白和炎症；此时，ADT降低了50%，但没有观察到自发发作。

意义：海马短暂暴露于白蛋白水平，与BBB显著击穿后的白蛋白水平相似，导致癫痫易感性增加，癫痫阈值长期降低，但不会诱发自发癫痫。这些效应可能由白蛋白诱导的星形胶质细胞功能障碍和相关的促炎分子诱导介导。

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图1
图1
癫痫持续状态（SE）诱导后大鼠海马水平和血清白蛋白的组织分布(A–C)与大鼠白蛋白注射液在幼年大鼠体内的比较(D–F型). 面板A类描述了大鼠SE诱导24小时后海马中获得的大鼠血清白蛋白水平（每组n=7）。面板B类和C类是低倍和高倍CA3区的代表性图片，描绘了大鼠血清白蛋白在脑实质中的分布。SE后2小时，白蛋白信号主要是细胞外信号(B类)，而在24小时时，在CA3锥体神经元中观察到白蛋白染色(C类). 面板天显示大鼠海马在静脉注射500后2小时和24小时的白蛋白浓度μ克/4μl大鼠白蛋白（每组4只大鼠）。面板E、 F类描绘海马FITC-白蛋白的分布（500μ克/4μl、 i.c.v.）表示其在注射后2小时的细胞外积聚和注射后24小时在CA3锥体神经元中的神经内信号。以条形图表示的数据为平均值±标准误差*p<0.05**与CTR相比，p<0.01（小组中的车辆注射大鼠A类或小组中注射右旋糖酐的大鼠天)通过两个独立组的Mann-Whitney U检验(A类)或者通过Kruskal-Wallis的单向方差分析，然后进行Dunn的多重比较检验(天). 比例尺100μm（低倍），25μm（高倍）。癫痫©ILAE版权所有
图2
图2
星形胶质细胞活化与IL-1β幼年大鼠注射大鼠白蛋白后的诱导。面板A、 E、I（第一列）描绘了IL-1分布区域的示意图β白蛋白注射后海马固有区的阳性细胞(E、 我)与注射右旋糖酐的大鼠相比(A类). 面板B、 C类描述IL-1β右旋糖酐注射大鼠（CTR）海马内的染色显示实质性缺乏(C类)或者几乎检测不到(B类)信号。面板F、 J型描述IL-1的增加β海马分子层（sm）胶质细胞内2h(F类)和24小时(J型)大鼠白蛋白注射后（500μ克/4μl、 注入坐标见方法部分）。辐射层（sr，K（K）)和灵芝（sl，未显示，见面板我)24小时，但不是2小时(G、 E类)在白蛋白之后。面板天显示了右旋糖酐注射海马中静息状态GFAP天冬氨酸细胞的高倍照片。面板H（H）和L（左）分别描述注射后2小时和24小时活化的GFAP阳性星形胶质细胞的形态学特征。面板哦描述了IL-1的共定位βGFAP在白蛋白注射大鼠海马层分子中。比例尺50μ米(B、 C、F、G、J、K), 25μ米(哦), 10μ米(D、 高、低). 面板N个描述了IL-1的总数β在面板中红色方框所示区域注射白蛋白与右旋糖酐（CTR）后，计数阳性细胞（平均值±标准误差，每组n=4-6只大鼠）M（M）与CTR相比，Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn多重比较检验p<0.05。Ipsi和contra分别指注射心室的同侧或对侧海马体。癫痫©ILAE版权所有
图3
图3
大鼠白蛋白注射后海马Kir4.1通道蛋白的Western blot分析。条形图显示了不同实验组中Kir4.1带的密度测定分析，即静脉注射后2或24小时（500μ克/4μl、 静脉注射大鼠白蛋白，或注射右旋糖酐（CTR）后，在注射后2小时和24小时检测到类似的条带；因此，这些值合并在一起）。在变性和还原缓冲条件下，我们测量了与42kDa带相对应的单体蛋白质(B类). 在低分子量下未检测到其他谱带，这反映了蛋白质降解不足（未显示）。数据（平均值±标准误差，n=6）是相关波段的光密度（O.D.）值除以相应的α-肌动蛋白值（内标）(B类). *与CTR相比，Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn多重比较检验p<0.05。癫痫©ILAE版权所有
图4
图4
大鼠白蛋白对基线和KA诱导的海马脑电活动的影响。静脉注射右旋糖酐（CTR，A–C)或大鼠白蛋白（500μ克/4μl）(D–F型)或者单独(A类和天分别）或KA后24小时（80 ng，海马内）(B、 C类和E、 F类）。面板A类描述了注射右旋糖酐后的脑电图活动，与注射前基线无差异。面板天描述了白蛋白注射同侧的高振幅、高频峰值活动（约8 Hz）。这种活动在注射后15分钟内发生，平均持续60分钟，并在2小时内恢复到基线水平（见图5）。面板B类和电子描述预先注射右旋糖酐的大鼠注射KA后记录的典型发作(B类)或白蛋白(电子). 面板C类和F类描述预先注射右旋糖酐的大鼠在KA后第三个小时内的峰值活动(C类)或白蛋白(F类). 括号中报告了跟踪放大。癫痫©ILAE版权所有
图5
图5
大鼠白蛋白注射后海马兴奋性和癫痫易感性的变化。(A类和C类)分别显示大鼠海马脑电活动的时间依赖性变化及其在静脉注射（500μ克/4μl） 白蛋白（红色，n=16）或右旋糖酐（CTR，蓝色，n=16）。(B类和天)显示KA在大鼠白蛋白预处理前2h（点红线，n=8）或24h（实心红线，n=8）诱发的痫样放电活动的时间依赖性变化。面板中的蓝线B类描述了KA（CTR+KA）前2 h（n=8）或24 h（n=8）用右旋糖酐预处理的大鼠中KA诱发的痫样棘波活动。因为这两组CTR+KA大鼠没有差异，所以将它们合并在一起（n=16，蓝线B类和蓝色条天). 面板中的箭头A类表示白蛋白或右旋糖酐注射的时间；面板中的箭头B类表示KA注入时间；基线是指白蛋白注射前15分钟的脑电图活动。面板A类：*p<0.05**p<0.01白蛋白（红线）与CTR（蓝线）。面板B类,天：°p<0.05白蛋白（红色虚线或条纹条）与CTR（蓝色实线或条），#p<0.01白蛋白（红色实线或条形）与CTR（蓝色实线或条状）；§180分钟时p<0.05（红色实线vs.红色虚线）。白蛋白本身诱发的累积棘波数（C，红色条）显著低于CTR+KA前2小时测量的棘波数。（p<0.05，Mann-WhitneyU型测试）。面板中的数据A、 B类通过双向方差分析和Bonferroni检验进行分析。面板中的数据天采用Kruskal-Wallis单因素方差分析和Dunn多重比较检验进行分析。癫痫©ILAE版权所有
图6
图6
大鼠白蛋白致痫阈值长期降低。方框图显示了右旋糖酐（CTR，n=6）或白蛋白注射（500）后3个月大鼠的海马后放电阈值μ克/4μl、 i.c.v.，n=7），通过电刺激海马隔极进行评估*与Mann-Whitney的CTR相比p<0.05U型测试。癫痫©ILAE版权所有
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