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.2012年10月26日；287(44):36744-55.
doi:10.1074/jbc。M112.398107。 Epub 2012年9月13日。

酵母线粒体磷脂酰丝氨酸脱羧酶1的加工和拓扑结构

苏珊娜·霍瓦思 1, 莉娜·勃廷格, F-Nora Vögtle公司, 尼尔斯·维德曼, 克里斯·梅辛格, 托马斯·贝克, 根特·道姆
附属公司

酵母线粒体磷脂酰丝氨酸脱羧酶1的加工和拓扑结构

苏珊娜·霍瓦思等。 生物化学杂志. .

摘要

线粒体内膜通过生物合成非双层形成的脂质磷脂酰乙醇胺和心磷脂，在细胞脂质稳态中发挥着至关重要的作用。在酿酒酵母中，大多数细胞磷脂酰乙醇胺是由线粒体磷脂酰丝氨酸脱羧酶1（Psd1）合成的。Psd1的生物成因涉及几个处理步骤。据推测，Psd1前体被分拣到内膜中，随后通过蛋白水解去除疏水分拣信号释放到膜间空间。然而，参与Psd1前体成熟的成分尚未确定。我们表明，Psd1的加工涉及线粒体加工肽酶和Oct1的作用，以及在高度保守的LGST基序上的自催化裂解，产生酶的α和β亚基。Psd1β亚单位（Psd1α）形成膜锚，与膜间空间放大的α亚单位（Psd1α）结合。β-亚基跨膜段缺失导致Psd1定位错误，酶活性降低。令人惊讶的是，自动催化裂解并不依赖于线粒体内膜的正确定位。总之，Psd1的膜整合对其功能和维持线粒体脂质稳态至关重要。

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图1。
图1。
Psd1的β亚基将Psd1α亚基连接到内膜。 A类，使用的Psd1构造如示意图所示。机器翻译预测线粒体靶向序列；感应电动机，推测内膜分选信号。B，通过SDS-PAGE分离来自表达Psd1HA、Psd1S463A或Psd1ΔIM的酵母菌株的线粒体蛋白，并通过所示抗体的免疫检测进行可视化。C类将完整的、肿胀的或溶解的（使用Triton X-100）线粒体与蛋白酶K孵育或不与蛋白酶K孵化。随后，对样品进行SDS-PAGE，并用相应的抗血清通过免疫检测显示所示成分。D类线粒体进行碳酸盐萃取。总计(吨)，膜结合(P（P）)和可溶性蛋白质(S公司)用SDS-PAGE分离，并用所示抗血清进行免疫检测以显示成分。E类用抗-HA亲和矩阵沉淀Psd1HA。SDS-PAGE分离负载（5%）和洗脱蛋白（100%），并用指示的抗血清进行免疫检测。
图2。
图2。
Tom70和Tom22是Psd1前体进入线粒体的主要受体。 A–C,35在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，S标记的Psd1前体从野生型导入线粒体，汤姆22Δ (A类),汤姆20Δ (B)，或汤姆70Δ (C类). 随后，用或不用蛋白酶K培养线粒体(保护。K（K）).35S标记蛋白通过放射自显影术检测。成熟形式Psd1β的时间依赖性形成(米)用ImageJ定量线粒体中的。Psd1β最长导入时间点(米)野生型线粒体被设定为100%。S.E.四次测量的平均值(误差条)如图所示。用所示抗血清进行免疫检测作为负荷对照。第页，前体；我1,我2，中间体1和2；米，成熟Psd1β。
图3。
图3。
MPP和Oct1处理Psd1前体。 A类用SDS-PAGE分析了几个缺失菌株的线粒体蛋白。用Psd1特异性抗体进行免疫检测，显示Psd1的β亚单位。B,35在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，S标记的Psd1前体从野生型或10月1日Δ. 随后，用或不用蛋白酶K培养线粒体(保护。K（K）).35S标记蛋白通过放射自显影术检测。P（P），前体；我1,我2，中间体1和2；米，成熟Psd1β。C类,35在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，S标记的Psd1和Psd1S463A前体从野生型或石块突变株。随后，用或不用蛋白酶K培养线粒体。35S标记蛋白通过放射自显影术检测。D类,35S标记的Psd1遇见在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，在Psd1的C末端含有六种蛋氨酸的线粒体从野生型或石块突变株。35放射自显影检测S-标记的Psd1α。E类、实验方案和脉冲相位实验35S-标记的Psd1进入野生型线粒体。35在标准导入条件下，在25°C下将S-标记的Psd1导入野生型线粒体5分钟(车道1;脉冲). 在重新分离和清洗步骤后，线粒体在进口条件下进一步孵化，但没有添加新的35S-标记前体(车道2和三,蔡斯).35S标记蛋白通过放射自显影术检测。
图4。
图4。
TOM复合物捕获的Psd1前体进行自催化处理。 A类,35在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，将S标记的Psd1和Psd1S463A前体导入野生型线粒体(保护。K（K）).35S标记蛋白通过放射自显影术检测。第页，前体；我1,我2，中间体1和2；米，成熟Psd1β。B,35S标记的Psd1遇见在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，在Psd1的C末端含有六种蛋氨酸，从野生型线粒体导入。35放射自显影检测S-标记的Psd1α。用ImageJ定量线粒体中Psd1α的时间依赖性形成。在存在膜电位的情况下，Psd1α进入野生型线粒体的最长输入时间点设置为100%。S.E.三次测量的平均值(误差线)如图所示。C类,35S标记的Psd1前体在没有膜电位的情况下导入野生型线粒体。线粒体与Tom5或Tom22抗体或免疫前血清孵育，作为对照。随后，用蓝色天然凝胶电泳分离裂解线粒体的蛋白质复合物。35放射自显影法检测S标记蛋白。D类,35S-标记的Psd1前体在没有膜电位的情况下导入野生型Tom22伊斯，汤姆70伊斯和Tom40哈随后，利用His和HA标签对线粒体进行裂解和亲和纯化。负载（4%）和洗脱蛋白（100%）通过SDS-PAGE分离并通过放射自显影术分析。我1，中间1。E类,35S标记的Psd1遇见在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，前体从野生型导入线粒体，汤姆70Δ,汤姆20Δ和汤姆22Δ.35放射自显影检测S-标记的Psd1α。
图5。
图5。
Psd1的自催化过程仅限于线粒体，但不依赖于Psd1正确的分类。 A类,35S标记的Psd1前体在膜电位（Δψ）存在的情况下输入野生型线粒体(麻省理工学院)和犬胰腺微粒体(工业界集团).P（P），前体；我1,我2，中间体1和2；米，成熟Psd1β。B，来自表达Psd1ΔIM的酵母菌株的完整、肿胀或裂解的线粒体（用Triton X-100）与蛋白酶K一起或不与蛋白酶K一起孵育(保护。K（K）). 随后，对样品进行SDS-PAGE，并用所示抗血清进行免疫检测以显示蛋白质。C类,35在存在或不存在膜电位（Δψ）的情况下，将S标记的Psd1或Psd1ΔIM导入野生型线粒体。35S标记蛋白通过放射自显影术检测。对于负荷控制，线粒体Hsp70（Ssc1(秒树-秒多事亚科C类/线粒体Hsp70））用特异性抗体进行免疫检测。第页，前体；我1和我2，中间体1和2；米，成熟Psd1。
图6。
图6。
Psd1的内膜定位是获得最佳酶活性所必需的。 A类使用从野生型和指定的Psd1突变体中分离的线粒体测量磷脂酰丝氨酸脱羧酶活性。菌株在30°C的最低半乳糖培养基上生长。显示了三个独立测量的平均值和S.D.值。B和C类，磷脂从线粒体中提取(B)和匀浆(C类)从野生型和指示的Psd1突变体中分离得到。菌株在30°C的最低半乳糖培养基上生长。有限合伙人，溶血磷脂；圆周率磷脂酰肌醇；个人计算机磷脂酰胆碱；DMPE公司，二甲基磷脂酰乙醇胺；PA公司，磷脂酸。两次独立测量的平均值和S.D.值(误差线)如图所示。
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