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.2012年8月；2(8):120104.
doi:10.1098/rsob.120104。

中心粒和周围中心粒材料之间界面的结构化照明

傅景燕 1, 大卫·M·格洛弗
附属公司

中心粒和近中心粒材料界面的结构照明

傅景燕等。 开放式生物. 2012年8月.

摘要

有丝分裂中心体大小的增加在一个多世纪前就有人描述过，但对位于中心体核心的中心粒在这一过程中如何组织中心粒周围物质（PCM）还知之甚少。现在，结构光照显微镜在果蝇身上显示，在PCM云出现之前，其蛋白质与两个管状层中的间期中心粒密切相关：一个内层被中心微管、Sas-4、Spd-2和Polo激酶占据；外层包括周中心蛋白样蛋白（Dplp）、Asterless（Asl）和Plk4激酶。在G2细胞中，中心体蛋白（Cnn）和γ-微管蛋白与此外管相关，在有丝分裂进入时，Polo活性需要将其与Spd-2一起招募到PCM云中。在此成熟过程中，Spd-2需要Cnn来扩展到PCM，但其本身可以独立于Spd-2对PCM作出贡献。相比之下，精母细胞的中心粒在G2减数分裂前从一个预先存在的近端单位伸长。Sas-4仅限于与微管相关的内圆柱，Dplp和Cnn仅限于此近端部分的外圆柱。在整个G2中心粒中，γ-管蛋白和Asl与外柱结合，Spd-2与内柱结合。虽然它们在G2中心粒上占据不同的空间隔室，但在进入减数分裂时，Cnn、Spd-2和γ-微管蛋白在中心粒处减少，成为PCM云的一部分。

关键词：果蝇；中心粒；近心点物质；超分辨率显微镜。

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数字

图1。
图1。
培养D.Mel-2细胞中心体中心粒蛋白的定位。D.Mel-2细胞染色以显示所示的中心粒蛋白。(一)Sas-4（绿色）和Dplp（红色）。上排显示了在原中心粒可见之前的中心粒。Sas-4的圆柱形结构与Dplp类似，但直径较小。当子中心粒伸长时，它被加载Sas-4（中间和底部行），而Dplp只装饰母中心粒。(b条)Spd-2（绿色）和Dplp（红色），或Spd-2和Sas-4（红色）。Spd-2位于Dplp（上排）内的气缸中，直径与Sas-4气缸相似。Sas-4存在于母子中心粒上，而Spd-2主要存在于母体中心粒上（中间和底部行）。(c（c）)Cep135（绿色）和Dplp（红色）。Cep135存在于母体中心粒的最内侧，并在反映伸长的水平上被招募到原中心粒。相反，无论子中心粒是否完全伸长，Dplp优先与母中心粒联系。(d日)Cp110（绿色）和Dplp（红色）。俯视图显示Cp110占据了向心柱的最中央部分（上排）。侧视图显示Cp110在单个中心粒（中间一排）的远端呈栓状体。染色显示Cp110（绿色）和Sas-4（红色）显示Cp110存在于母子中心粒的远端（底部一行）。(e（电子）)Asl（绿色）和Dplp（红色）显示了它们在圆柱形结构中的重叠分布。Asl在九倍对称结构中显示点状染色模式。(（f）)D.Mel-2细胞表达GFP-Plk4（绿色），染色显示Dplp（红色）。Plk4的分布与其伙伴蛋白Asl的分布极为相似。(克)D.Mel-2细胞染色显示α-微管蛋白（α-tub；绿色）和Dplp（红色）。α-微管蛋白存在于Dplp染色区域内的圆柱体中，该圆柱体可能对应于九组微管。它也见于女儿中间粒。比例尺(一–克)500纳米。
图2。
图2。
描述中心体结构和不同蛋白质分布的方案。(一,b条)母中心粒被分成五个区域，与我们描述的染色区域相对应。子中心粒中没有III区、IV区和II区的一部分（没有星号的蛋白质）。此外，区域III的部分（标记为#的蛋白质）仅在G2晚期开始积累。表中列出了每个区域中存在的蛋白质，区域的直径（±s.d.）由所示的染色模式定义。浴缸，微管蛋白。
图3。
图3。
中心体成熟期间中心粒物质（PCM）的发育。(一–c（c）)D.Mel-2细胞染色显示(一)Spd-2（绿色）和Dplp（红色）(b条)Cnn（绿色）和Dplp（红色），或(c（c）)γ-微管蛋白（绿色）和Dplp（红色）。图中显示了具有代表性的间期和中期中心粒。Spd-2定位于所有相间中心粒，而Cnn和γ-微管蛋白仅存在于一小部分相间中心粒上。这三种蛋白在间期均呈现柱状结构，Cnn和γ-微管蛋白柱的直径与Dplp柱的直径相似。另一方面，Spd-2围绕着中心粒核心更紧密。在有丝分裂期间，中心粒周围的Spd-2、Cnn和γ-微管蛋白大量积累，中心粒本身的核心仍能检测到Spd-2。比例尺：500 nm。(d日)表达GFP-Polo的D.Mel-2细胞染色显示Dplp。显示了间期（I）和中期（II）细胞的中心体。在间期细胞中，Polo既以Dplp圆柱体内的圆柱体形式存在于中心粒中，也存在于细胞质微管上。中期，Polo延伸至PCM，但不如Spd-2、Cnn和γ-微管蛋白广泛。上排比例尺：4μm；下行：500 nm。
图4。
图4。
Polo、Cnn和Spd-2在中心体成熟中的相互依赖性。(一,b条)用二甲基亚砜（DMSO）或BI2536处理D.Mel-2细胞16 h，或用谷胱甘肽S-转移酶（GST）、Spd-2或Cnn-dsRNA处理，并染色以显示γ-微管蛋白（绿色）、Dplp（红色）和磷酸氢istone H3 Ser10（未显示）。请注意，在抑制Polo或耗尽Spd-2或Cnn后，γ-微管蛋白从PCM中去除，中心粒上只剩下残余物。γ-微管蛋白的荧光强度定量标准化为Dplp的荧光强度。误差条表示s.e.m.，星号表示对< 0.0001. (c（c）,d日)用二甲基亚砜或BI2536或GST或Cnn-dsRNA处理D.Mel-2细胞16 h，并染色以显示Spd-2（绿色）、Dplp（红色）和磷酸化h istone H3 Ser10（未显示）。请注意，Polo抑制和Cnn耗竭都会从PCM中完全去除Spd-2，但中心粒中Spd-2的内柱状结构保持不变。将Spd-2在心室周围区域的总荧光强度的定量标准化为Dplp的总荧光强度。这需要减去内圆柱结构的荧光。误差条表示s.e.m.，星号表示对< 0.0001. (e（电子）,（f）)用DMSO或BI2536处理D.Mel-2细胞16 h，或用GST或Spd-2 dsRNA处理，并染色以显示Cnn（绿色）、Dplp（红色）和磷酸化h istone H3 Ser10（未显示）。定量显示Cnn的荧光强度或Cnn所占的总体积归一化为Dplp的荧光强度。误差条表示s.e.m.，星号表示对< 0.0001. 而在BI2536处理后，Cnn完全从PCM中去除，在Spd-2耗尽后，Cnn的荧光强度降低了56%，其体积占49%。(克)显示PCM组件层次结构的示意图。Polo定位于中心粒，只向PCM延伸一点。Spd-2占据中心粒的类似部分，但在PCM中更为分散。另一方面，Cnn和γ-微管蛋白仅存在于PCM中，位于Dplp的外侧。在PCM组装期间，Polo（可能是细胞质或中心粒相关）激活Cnn，使其定位于PCM。随后，他们都被要求为PCM招募Spd-2。Cnn与Spd-2合作招募γ-微管蛋白。此外，还需要Spd-2来维持Cnn水平。比例尺(一,c（c）,e（电子）)500纳米。
图5。
图5。
减数分裂前延伸G2中精母细胞中心粒的生长。(一)表达GFP-PACT（绿色）的G2进行性晚期初级精母细胞囊肿的中心柄染色显示Dplp（红色）。Dplp仍然与中心粒的铰链区和近端部分有关，中心粒的长度从大约360 nm增加到540 nm（红色）。在相同的时间间隔内，标有GFP-PACT的中心极微管的长度从250 nm增加到1.4μm（绿色）。(b条)成熟初级精母细胞中心粒（仍位于G2）表达GFP-PACT（绿色），染色显示Cep135（红色）。注意，Cep135沿着GFP-PACT圆柱体的长度向下延伸。(c（c）)成熟初级精母细胞中心粒染色显示Asl（绿色）和Dplp（红色）。Asl在直径与Dplp相似的圆柱体中沿着中心粒的长度延伸，仅限于近端；Sas-4（绿色）和Dplp（红色）。Sas-4和Dplp均局限于近端，而Sas-4染色包含在Dplp的染色范围内。(d日)表达GFP-PACT或GFP-Cep135（绿色）的未成熟初级精母细胞中心粒染色显示Cp110（红色）。注意，Cp110显示与GFP-PACT分离的远端定位。相反，Cep135超过PACT信号的远端，显示出与Cp110的空间相互作用。比例尺(一–d日)1微米。
图6。
图6。
初级精母细胞发育过程中PCM蛋白的定位。(一–c（c）)G2早期和晚期、减数分裂I和减数分裂II中的精母细胞中心粒染色显示Spd-2、Cnn、γ-微管蛋白（绿色）和Dplp（红色）。在G2早期和晚期精母细胞中，Spd-2定位于Dplp管内，但延伸至远端。Cnn和γ-微管蛋白与Dplp重叠；γ-微管蛋白也沿着中心粒的长度延伸，而Cnn主要但不限于近端。在减数分裂I和II期间，Spd-2、Cnn和γ-微管蛋白均向PCM扩张；Cnn与中心粒核的关系比Spd-2和γ-微管蛋白更密切。比例尺(一–c（c）)1微米。
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