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.2012年10月17日；31(20):4020-34.
doi:10.1038/emboj.2012.251。 Epub 2012年9月7日。

长非编码RNA的替代3'端加工启动核副啄木鸟的构建

高雄长沼 1, 中川信一, Akie Tanigawa先生, 亚斯诺里·F·佐佐木, 直系吾岛, 广泽铁雄（Tetsuro Hirose）
附属公司

长非编码RNA的替代3'端加工启动核副啄木鸟的构建

高雄长沼等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

副斑点是围绕特定长非编码RNA NEAT1构建的独特亚核结构，NEAT1由替代3'末端加工产生的两种亚型组成（NEAT1_1和NEAT1_ 2）。为了解决导致副啄形成的精确分子过程，我们鉴定了35个副啄蛋白（PSP），主要是通过用荧光蛋白标记的全长cDNA文库进行共定位筛选。大多数新鉴定的PSP具有各种假定的RNA结合域。随后的RNAi分析确定了形成副啄木鸟所必需的七个PSP。一种重要的PSP，HNRNPK，似乎通过负调控NEAT1_1亚型的3'端聚腺苷化来影响重要NEAT1_ 2亚型的产生。体外3'末端处理试验表明，HNRNPK在NEAT1_1的交替多聚腺苷化位点附近阻止了CPSF6-NUDT21（CFIm）复合物的结合。体外结合试验表明，HNRNPK与CPSF6竞争与NUDT21的结合，这是HRNPK阻止CFIm结合的潜在机制。该HNRNPK功能导致NEAT1_2的优先积累，并启动了具有多个PSP的副啄结构。

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数字

图1
图1
NEAT1_2是副啄形成的一种有效RNA成分。(一)NEAT1_2而非NEAT1_拯救副啄木鸟形成。用小鼠NEAT1 ncRNA反义探针和内源性SFPQ联合免疫抑制RNA-FISH检测完整的副啄木鸟。从NEAT1基因敲除小鼠（KO）制备的MEF细胞中未检测到WT MEF细胞内观察到的副斑点。在转染表达NEAT1_1（KO+NEAT1_）或NEAT1\2（KO+NEAT1_ 2）的质粒的KO-MEF细胞中检测到副斑点。(B类)放线菌素D治疗对重组副啄状病灶的影响。KO-MEF细胞与表达NEAT1_2 ncRNA和SFPQ–Flag的质粒共转染。用0.3μg/ml放线菌素D处理转染细胞4 h。用NEAT1的RNA-FISH观察重组的副啄状病灶，并用抗Flag M2抗体进行免疫复合。(C类)NEAT1_2 ncRNA比NEAT1_ 1 ncRNA更能提高副啄木鸟的数量。将NIH3T3细胞与对照（+对照）、NEAT1_1（+NEAT1_ 1）或NEAT2_ 2（+NEAT1_ 2）的表达质粒以及SFPQ–Flag共同转染。计算出的副啄木鸟数量如补充图S1D所示。比例尺，10μm。
图2
图2
新型PSP组件的鉴定。(一)识别新PSP的实验策略。(B类)选择FLJ-Venus克隆，定位于类副啄核病灶。SFPQ免疫染色显示副斑点。显示了新PSP的三个代表（PSP10、PSP14和PSP33）。(C类)证实了内源性PSP对应物的旁啄定位。使用针对PSP10、PSP14和PSP33各对应物的抗体（分别为EWSR1、FUS和TAF15）来监测定位（见补充表S4）。NEAT1 ncRNA被用作副啄木鸟标记。(D类)放线菌素D处理对选定PSP定位模式的影响。金星无性系的定位B类放线菌素D处理后进行监测。SFPQ是一种内源性PSP控制。关于其他PSP的数据如补充图S2和S3所示。比例尺，10μm。
图3
图3
通过广泛RNAi处理在副啄形成中新PSP的功能分配。通过RNA-FISH和RPA监测副斑点外观和NEAT1水平，以检测NEAT1_1和NEAT1_ 2。(一)用对照siRNA处理的细胞中的副斑点(B类)使用的RPA探针和NEAT1_1和NEAT2_2的受保护碎片（大小为nt）的模式。各类别代表的数据（1A:RBM14、1B:PSP8/DAZAP1、2:PSP21/HNRNPR、3A:PSP34/UBAP2L、3B:PSP36/ZNF335）如所示(C类–G公司)分别是。RNA-FISH分析中使用的siRNA编号（#）显示在每张照片的左下方。对于RPA，通过U12-snRNA的带强度归一化的两种亚型的带强度的比率如下所示（Ctl定义为100%）。关于所有PSP的RNAi数据汇编在补充图S4中。其量化数据见补充表S3。使用的siRNAs如补充表S6所示。比例尺，10μm。图源数据可以通过补充数据找到。
图4
图4
编制PSP。属于第1类的PSP的主要域示意图(一), 2 (B类)、和3(C类)分组并显示。未分类的PSP如所示(D类). 类别1和3中的子类别在中显示为1A和1B(一)和3A和3B英寸(C类). 每个PSP的氨基酸长度显示在右角。四个假定的RNA-结合域的色码显示在右侧。
图5
图5
NEAT1的选择性3′端加工是副啄形成的基本步骤。(一)NEAT1替代3′端处理所需的PSP。如图3所示执行RPA。显示了NEAT1_1 3′末端处理所需的NUDT21和CPSF6的数据，以及通过干扰NEAT1_ 1 3′端处理合成NEAT1_i所需的HNRNPK的数据。(B类)用抗NUDT21、CPSF6或HNRNPK的siRNAs处理的HeLa细胞中的副斑点现象。(C类)质粒修复HNRNPK缺失细胞中NEAT1_2合成缺陷。使用两个针对HNRNPK的siRNAs（K#2和K#3）来消除内源性HRNPK，并引入三种浓度（1–5μg）的HNRNPC拯救质粒（K）。如图3所示，通过RPA测量NEAT1 ncRNA水平。上面板下方显示了NEAT1_1与NEAT1_ 2（NEAT1_e/NEAT1_2）的比率。western blotting（WB）检测GADPH和HNRNPK。(D类)通过HNRNPK的质粒表达挽救了副斑点形成。所使用的siRNA和拯救质粒分别显示在左侧和顶部。通过NEAT1的RNA-FISH检测到副斑点。通过αFlag免疫染色观察转染细胞。箭头表示在获救的牢房中形成的副啄鸟。比例尺，10μm。(E类). 中结果的量化(D类). 计数具有一个以上副啄状病灶的细胞。计数的总细胞数是补充表S6中所示的使用的siRNA。P（P）-值由Student的t吨-测试。对照组和HNRNPK缺失的细胞计数分别为152和136。
图6
图6
CFIm和HNRNPK在NEAT1_1 3′端加工中的作用。(一)底物RNA的示意图在体外包含跨越NEAT1_1 3′端区域的加工反应。数字表示与NEAT1_1的多聚腺苷化位点的距离。中间方案表示NEAT1_1 3′端加工位点周围的假定序列，这些序列被CFIm复合体（CFBS：红框）或HNRNPK（KBS：蓝框）识别。指出突变底物（CFIm-mut、K-mut和PAS-mut）上的突变位置。(B类)NEAT1_1依赖CFI的3′端加工综述在体外。孵化时间显示在每个面板的上方。底物RNA显示在顶部。未处理和已处理的标注栏在右侧分别显示为闭合三角形和开放三角形。每个面板下方显示了处理效率（%）。(C类)从三个独立实验中获得的处理效率的平均值。(D类)HNRNPK序列特异性RNA结合检测。显示了凝胶迁移率变化分析，以检测重组HNRNPK蛋白（r-K）与分别来自WT和K-mut、WT寡核苷酸和K-mut-oligo的RNA片段（30 nt）的结合。核糖核酸-蛋白质复合体和游离核糖核酸分别用闭合三角形和开放三角形表示。每个面板上方显示了补充的r-K（μg）量。
图7
图7
NEAT1选择性3′端加工的分子机制。(一)CFIm的RNA结合检测在体外通过紫外线交联处理。紫外线交联WT底物RNA-结合蛋白检测为32SDS-PAGE上的P标记蛋白质。用抗CPSF6和NUDT21抗体免疫沉淀68和25-kDa UV交联RNA-结合蛋白（分别为闭合箭头和开放箭头）。(B类)CPSF6和NUDT21的RNA结合受r-K添加的影响。使用的两种RNA底物（WT和K-mut）显示在顶部。在两种浓度（HNE中内源性HNRNPK的10倍和30倍过量）下添加r-K（+）和培养时间（min）如上所示。闭合三角形和开放三角形如所示(一). 68-和25-kDa条带的强度分别通过CPSF6和NUDT21的水平进行量化和归一化，这两个水平由如下所示的western blot（WB）检测。分子量标记如左图所示。(C类)确认r-K依赖性抑制CPSF6和NUDT21的RNA结合。面板上方显示r-K（30×过量）的存在（+）或不存在（−）。在输入通道（+r-K）和补充图S6B中检测到r-K（～55 kDa）的紫外线交联。闭合三角形和开放三角形如所示(一). 输入样品和免疫沉淀样品中的NUDT21数量由面板下方显示的WB检测。星号代表IgG轻链。(D类)在有（+）或无（−）r-K的情况下定量免疫沉淀、UV交联NUDT21（C类). 用每个免疫沉淀样品中NUDT21的总量对数据进行标准化（下图C类). 图表显示了三个独立实验的平均值（含s.d.）。P（P）-值由Student的t吨-测试。(E类)免疫沉淀CPSF6的定量，如(D类). 抗体见补充表S4。图源数据可以通过补充数据找到。
图8
图8
HNRNPK从功能性CFIm复合体中捕获NUDT21。(一)HNRNPK和NUDT21之间的相互作用体内在RNase A存在（+）或不存在（-）的情况下，用αNUDT21和αCPSF6进行免疫沉淀。WB检测到CPSF6、NUDT21及HNRNPK。(B类)CPSF6–NUDT21相互作用受HNRNPK的影响。在存在WT RNA的情况下，用r-K培养HNE。在存在（+）或不存在（-）r-K的情况下用αNUDT21进行免疫沉淀。WB检测CPSF6、NUDT21、HNRNPK和GAPDH。在r-K存在时，CPSF6的免疫沉淀减少。星号表示多余的r-K与IgG的非特异性结合。(C类)在存在或不存在r-K的情况下，免疫沉淀的CPSF6的定量。CPSF6的相对量（%）通过免疫沉淀的NUDT21水平标准化(B类). 图表显示了三个独立实验的平均值（带SD）。P（P）-值由Student的t吨-测试。(D类)净化CFIm复合物。SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝染色。CPSF6和SBP–NUDT21都具有标志和HA-标签。尺码制造商如左图所示。(E类)竞争性结合分析的示意图F类CFIm复合物（30 pmol NUDT21–CPSF6复合物，白色圆圈）通过SBP-tag（小黑色圆圈）固定在链霉亲和素结合珠（黑色四分之一圆圈）上。将重组HNRNPK（0-90 pmol r-K，灰圈）与珠子混合。r-K与NUDT21的结合预计会导致CPSF6从珠子中分离。BSA（90 pmol）作为对照。(F类)检测珠（珠）和上清液（Sup）组分中的CPSF6、NUDT21和HNRNPK。结合反应中的蛋白质在面板顶部显示为+。如面板右侧所示，每种蛋白质都通过western blot检测。输入通道中装载了1/30的所用蛋白质。使用的抗体见补充表S4。图源数据可以在补充数据中找到。
图9
图9
(一)NEAT1亚型合成模型。NEAT1边界区域显示为关键序列元素。NEAT1_1和NEAT1_ 2合成的途径显示在NEAT1方案的上方和下方。对于NEAT1_2合成，HNRNPK与UCCCCUU序列结合，从功能CFIm（CPSF6–NUDT21）捕获NUDT21，并阻止CFIm与上游UGUA序列的结合。(B类)完整副啄形成的当前模型。基本步骤，包括1）通过RNA聚合酶II（RNAPII）持续转录NEAT1，2）通过选择性3′末端加工合成NEAT1_2，3）通过1A类蛋白质（如SFPQ和NONO）稳定NEAT1_ 2，以及4）后续组装步骤，均以粗体黑色箭头表示。1B类蛋白质在NEAT1_2积累以外的重要步骤中发挥作用。NEAT1_1合成是可有可无的；因此，它显示为白色箭头。NEAT1_1和NEAT1_ 2的3′端由不同的机制形成：典型聚腺苷酸化（开放三角形）和RNase P裂解（闭合三角形）。NEAT1_2的非经典3′端加工的意义尚不明确。
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