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.2012年11月1日；186(9):866-76.
doi:10.1164/rccm.201204-0754OC。 Epub 2012年8月30日。

脱细胞正常和纤维化人肺基质作为体外研究的培养体系

亚当·J·布斯 1, 瑞恩·哈德利, 阿什利·M·科内特, Alyssa A Drefs公司, 斯蒂芬妮·马修斯, 杰西卡·L·翠, 凯文·韦斯, 杰弗里·霍洛维茨, 文森特·菲奥雷, 托马斯·H·巴克, 贝萨尼·B·摩尔, 费尔南多·马丁内斯, 劳拉·尼古拉森, 埃里克·S·怀特
附属公司

脱细胞正常和纤维化人肺基质作为体外研究的培养体系

亚当·J·布斯等。 Am J Respir Crit Care Med公司. .

摘要

理论基础：细胞外基质（ECM）是一种有助于器官完整性和功能的动态组织，其对细胞表型的调控是细胞生物学的一个重要方面。然而，标准的体外培养方法在生理学上的相关性尚不明确，因为它们不能模拟活器官的组成、结构或可膨胀性。在肺中，成纤维细胞存在于富含ECM的间质空间中，是肺纤维化发生的关键影响因素。

目标：为了更好地解决ECM如何以疾病特有的方式影响成纤维细胞表型，我们开发了一种使用脱细胞人正常肺和纤维化肺的培养系统。

方法：脱细胞是通过使用洗涤剂、盐和DNA酶进行处理来实现的。所得基质可被切成均匀的切片，细胞在其中培养。

测量和主要结果：我们报告说，脱细胞过程有效地去除细胞和核材料，同时保持肺组织的固有尺寸和硬度。我们证明，植入无细胞肺基质的肺成纤维细胞可以随后使用常规方案进行检测；通过这种方式，我们发现与正常基质相比，纤维化基质明显促进转化生长因子-β非依赖性肌成纤维细胞的分化。此外，对脱细胞基质ECM的综合分析详细说明了正常肺和纤维化肺之间的显著成分差异，为进一步研究新假设铺平了道路。

结论：该方法有望用于研究人体组织中基于ECM的重要假设，并允许未来以特定器官和疾病的方式进行科学探索。

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数字

图1。
图1。
天然和脱细胞人正常肺的组织学评价。(一个)自然人正常肺，苏木精和伊红（H&E）染色。(B类和C类)去细胞人肺10×H&E染色(B类)和40×(C类)放大倍数。(D类)Verhoeff弹性蛋白染色(E类)阿尔西安蓝，以及(F类)马森三色染色（均为10倍放大）。脱细胞过程使肺结构保持完整。
图2。
图2。
天然和无细胞人特发性肺纤维化（IPF）肺的组织学评价。(一个)天然人IPF肺、苏木精和伊红（H&E）染色。(B类和C类)去细胞人IPF肺10×H&E染色(B类)和40×(C类)放大倍数。(D类)Verhoeff弹性蛋白染色(E类)阿尔西安蓝，以及(F类)马森三色染色（均为10倍放大）。脱细胞过程使肺结构保持完整。
图3。
图3。
确认细胞蛋白和DNA去除。(一个)前右缘细胞蛋白的Western blot分析(车道1和三)以及之后(车道2和4)去细胞化；n=2个单独的肺样本。结果代表了三种蛋白质印迹。(B类)非脱细胞肺中不同看家基因的实时半定量聚合酶链反应(封闭式钢筋)和脱细胞肺基质(开放式酒吧). 与自然肺组织相比，脱细胞基质中各基因的相对表达低于99.95%。结果来自两个单独的实验。α-SMA=α-平滑肌肌动蛋白；β-2-MG=β-2-微球蛋白；β-glc=β-葡萄糖醛酸酶；CD71=转铁蛋白受体；CycA=亲环素A；G3PDH=甘油醛-3-磷酸脱氢酶；HPRT1=次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1；HSP90=热休克蛋白90 kDα（细胞溶质）；L13a=核糖体蛋白L13a；P0=核糖体蛋白，大；PTEN=第10号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物*P（P）< 0.005, **P（P）< 0.01, ***P（P）< 0.001.
图4。
图4。
脱细胞前后人类肺部的大体外观。以前认为不适合移植的正常肺和特发性肺纤维化肺(一个和B类（分别为）和之后(C类和D类）去细胞化。肺部保持正常的大体结构和解剖关系。
图5。
图5。
术前正常肺基质的扫描电镜观察(一个–C类)以及之后(D类–F类)去细胞化。(一个)正常肺泡。白色箭头显示正常牙槽壁。箭头显示肺泡巨噬细胞；850倍放大。(B类)纤毛支气管；500倍放大倍数。(C类)肺血管。血细胞粘附在壁上；995倍放大倍数。(D类)无细胞肺泡；1020倍放大倍数。（E） 无纤毛衬里细胞的脱细胞支气管；放大100倍。(F类)无衬里细胞的脱细胞血管；2000倍放大倍数。比例尺=10μm。
图6。
图6。
正常和特发性肺纤维化（IPF）脱细胞肺基质的透射电镜观察。在正规矩阵中(左侧面板)肺泡上皮和血管内皮基底膜(黑色箭头)厚度均匀，间质有组织的胶原纤维(白色箭头)和离散的弹性蛋白束(白色箭头). 相反，IPF矩阵(右侧面板)显示出明显增厚的异质基底膜(黑色箭头)以及位置杂乱、无组织的胶原蛋白纤维(白色箭头)有无组织的弹性蛋白碎片(白色箭头). 未观察到蜂窝材料。A=牙槽间隙。V=血管间隙。两个面板，放大8520倍。比例尺=2微米。
图7。
图7。
通过原子力显微镜测定天然和脱细胞正常和特发性肺纤维化（IPF）肺基质的硬度（n=2个样本/条件；每种颜色代表不同的个体）。(一个)自然正常人肺的杨氏模量平均值（±SEM）为1.96±0.13 kPa，而自然IPF肺的平均刚度为16.52±2.25 kPa，显著高于正常组织(P（P）<0.0001（通过Mann-Whitney试验）。(B类)脱细胞正常肺的平均（±SEM）弹性（杨氏）模量约为1.6（±0.08）kPa。通过比较，去细胞IPF肺的平均（±SEM）杨氏模量为7.34±0.6 kPa。每个点代表一个30×30μm的单个测量值2区域*P（P）< 0.0001.
图8。
图8。
表1中报告了通过液相色谱-串联质谱法评估的紧邻组织的正常和特发性肺纤维化肺组织的苏木精和伊红染色（10倍放大）。
图9。
图9。
特发性肺纤维化（IPF）基质诱导正常人肺成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达。(一个)Western blot分析正常人肺成纤维细胞在人脱细胞正常肺基质或IPF肺基质中培养。相同传代的细胞在基质中培养48小时后收获。IPF肺基质显著诱导α-SMA。条形图描述了归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的α-SMA的平均（±SEM）密度比。该印迹是使用三种不同的原代细胞系和来自三个独立个体的基质进行的三次重复实验的代表。(B类)正常成纤维细胞接种于正常组织的α-SMA免疫组化(左侧面板)或IPF(右侧面板)基质48小时；放大20倍。
图10。
图10。
特发性肺纤维化（IPF）基质中成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白表达增强与转化生长因子（TGF）-β无关。(一个)正常人肺成纤维细胞在正常或IPF基质中培养24小时，在transwell系统的上孔中培养1×105水貂肺上皮细胞（MLEC）在下腔培养。用光度计分析MLEC的裂解物，并在上面绘制相对强度。正常或IPF基质释放的TGF-β活性没有差异。结果来自三个单独的实验，每个实验在三份组织切片中进行。(B类)对完整的脱细胞基质进行酸活化，并通过酶免疫分析对所得培养基的TGF-β水平进行分析。正常和IPF切片之间的总TGF-β无差异。数据是来自三个独立正常组织和五个独立IPF组织的样本的合并平均值（±SD）。(C类)在ALK5抑制剂A83-01或二甲基亚砜（载体对照）存在下，将正常肺成纤维细胞（n=2）接种在来自两个不同供体的三份IPF基质中48小时。通过Western blot评估裂解产物对α-SMA的诱导作用。综合密度测定评估显示各组之间没有差异，表明α-SMA诱导是TGF-β独立的。
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