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.2012;7（8）：e43199。
doi:10.1371/journal.pone.0043199。 Epub 2012年8月20日。

内皮素B受体在青光眼大鼠模型视网膜神经节细胞丢失中的作用

阿莱娜·明顿 1, Nitasha R Phatak公司, 多罗塔·斯坦考斯卡, 何少清, 马海英, 布雷特·穆勒, 明江, 罗伯特·卢特克, 杨少华, 科尔比·布朗利, Raghu R Krishnamoorthy公司
附属机构

内皮素B受体在青光眼大鼠模型视网膜神经节细胞丢失中的作用

阿莱娜·明顿等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

青光眼是一种视神经病变，通常与眼压升高（IOP）有关，其特征是视神经变性、视盘杯状化和视网膜神经节细胞丢失，这可能导致视力下降。内皮素-1（ET-1）是一种21氨基酸的血管活性肽，在青光眼的发病机制中起关键作用；然而，介导这些效应的受体尚未确定。在本研究中，在大鼠青光眼的Morrison高眼压模型中，对内皮素B（ET（B））受体的体内表达进行了评估。Brown Norway大鼠眼压升高导致视网膜ET（B）受体表达增加，主要在视网膜神经节细胞（RGCs）、神经纤维层（NFL）以及内网状层（IPL）和内核层（INL）。为了确定ET（B）受体在神经退行性变中的作用，对Wistar-Kyoto野生型（WT）和ET（B）受体缺乏（KO）大鼠进行荧光金（FG）逆行标记，随后一只眼睛的眼压升高，另一只眼睛作为对照。WT大鼠4周内眼压升高导致RGC明显减少，KO大鼠的RGC明显减弱。此外，与WT大鼠相比，KO大鼠的视神经退行性改变显著减少。综上所述，眼压升高介导的ET（B）受体表达增加及其激活可能导致青光眼患者RGC存活率下降。这些发现增加了使用内皮素受体拮抗剂作为神经保护剂治疗青光眼的可能性。

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数字

图1
图1。眼压升高导致ET显著增加B类受体在大鼠视网膜中的表达。
2周典型眼压升高曲线(A类)和4周(C)成年Brown Norway大鼠。一只眼睛的眼压升高（闭眼圈），另一只眼睛作为对侧对照眼（开眼圈）。该实验在6只Brown Norway大鼠中进行，为期2周，7只Brown挪威大鼠中完成，为期4周，眼压升高。眼压值绘制为平均值±SEM。2周后的视网膜切片(B类)和4周(D类)眼压升高大鼠眼睛ET免疫染色B类使用定制兔多克隆ET的受体表达（绿色荧光）B类受体特异性抗体。白色箭头表示ET免疫染色增加的RGCB类观察受体。省略初级抗体孵育的视网膜切片标记为空白，显示最小荧光。NFL、神经纤维层；神经节细胞层；IPL，内丛状层；OPL，外丛状层；INL，内核层；OPL，外树脂层；OS，杆外段。比例尺指示20µm。
图2
图2。ET增加B类大鼠眼压升高后荧光金标记视网膜神经节细胞的受体免疫染色。
答：。成年Brown Norway大鼠2周典型眼压升高曲线。成年雄性Brown Norway大鼠（n = 3） 用荧光金（FG）逆行标记RGC。对这些大鼠的一只眼睛进行眼压升高，并维持2周，而另一只眼睛作为对侧对照。B。ET免疫组织化学染色B类用眼压升高眼及其对应的对侧对照眼的视网膜切片进行受体抗体检测，并用Alexa 647结合二级抗体进行检测。在共焦显微镜上拍摄荧光图像，并合并ET图像B类获得FG免疫荧光（Merge）。比例尺指示20µm。
图3
图3。电子技师B类眼压升高的Brown Norway大鼠视网膜中的受体结合活性增加。
答：。成年雄性Brown Norway大鼠的眼压升高曲线。一只眼睛的眼压升高（治疗眼：闭眼圈），另一只眼睛作为对侧对照眼（开眼圈）。实验在三只棕色挪威大鼠（n = 3） 由大鼠1、大鼠2和大鼠3表示。B。Scatchard绑定图125I-ET-1对对侧对照和眼压升高的大鼠视网膜膜。数据点表示三次结合反应的平均值（圆圈表示内皮素受体结合总量，三角形表示内皮素B类受体结合）。使用三只大鼠（大鼠1、大鼠2和大鼠3）的对侧对照眼进行了三个单独的结合实验。图中显示了代表结合位点总数的Bmax（fmol/mg）。B/F代表结合与游离放射性ET-1配体的比率。在相同条件下同时对对照组和升高眼压组的眼睛进行结合分析。
图4
图4。与WT大鼠相比，KO大鼠在眼压升高后RGC丢失减弱。
答：。WT和KO大鼠的眼压升高曲线。FG标记后，一只眼睛的眼压升高（闭眼圈），另一只眼睛作为对侧对照眼（开眼圈）。眼压值绘制为平均值±SEM。B。WT和KO大鼠对侧视网膜和眼压升高视网膜中逆行标记视网膜神经节细胞的荧光图像。C、。视网膜扁平支架四个象限中三个偏心率（E1、E2和E3）的RGC计数分析方案。D。不同偏心度的左眼（IOP升高）和右眼（对侧）之间荧光金标记RGCs的比例图。比较WT和KO大鼠的三种偏心率（E1、E2和E3）。KO大鼠RGC存活率显著增加（n = 4） 与WT大鼠相比（n = 3). 横线表示平均值±SEM。*表示秩上方差分析的显著性（p<0.05），然后进行成对多重比较（Dunn方法）。比例尺表示20µm。
图5
图5。眼压升高后KO大鼠与WT大鼠视神经轴突存活率的比较。
WT和KO大鼠的一只眼眼压升高，而另一只眼作为相应的对侧对照。大鼠在眼压升高后维持4周。处死大鼠，视神经切片用对苯二胺染色。黑点（白色箭头）表示轴突正在死亡/退化。与眼压升高的KO大鼠相比，WT大鼠的胶质瘢痕形成（黑色箭头）更为丰富。比例尺指示20µm。
图6
图6。原代大鼠视网膜神经节细胞（RGCs）内皮素受体表达的免疫细胞化学分析。
从出生后第3-7天的幼鼠中分离出原代大鼠RGC，并对其进行免疫细胞化学分析(A类)电子技师B类和(B类)电子技师A类使用定制的ET进行表达B类抗体和市售ETA类抗体。使用相应的Alexa 647结合二级抗体检测免疫染色。(C)一个阴性对照免疫染色（空白），其中省略了一级抗体，显示出最小的染色。用DAPI对细胞进行复染以检测细胞核。比例尺指示20µm。
图7
图7。用内皮素处理的原发性RGCs的活死亡测定。
答：。初级视网膜神经节细胞取自出生后第3-7天的幼鼠，并接种在盖玻片上。这些细胞未经处理（对照），或用10 nM ET-1、100 nM ET-1,100 nM ET-3处理24小时。处理后，添加钙黄绿素AM（绿色荧光指示活细胞）和埃塞俄比亚同二聚体（EtHD）（红色荧光指示死细胞）的混合物，并评估细胞活力。B。用ET-1（10 nM）、ET-1（100 nM）和ET-3（100 nM）处理原代RGC后的死亡细胞百分比图。该图表示三个独立实验的平均值，条形图表示平均值±SEM。*通过Kruskal-Wallis单向方差分析（ANOVA）对等级进行统计显著性（p<0.05），然后进行Dunn的多重比较。比例尺指示100µm。
图8
图8。经内皮素处理的原代RGC的TUNEL分析。
原发性RGC要么未经治疗，要么接受ET-1（10 nM）、ET-1（100 nM）或ET-3（100 nM）治疗，并进行TUNEL分析以检测凋亡。左侧垂直面板（TUNEL）显示了含有荧光dUTP的细胞的荧光图像，表明细胞凋亡。右侧垂直面板（DAPI）显示了使用DAPI染色的细胞核。比例尺显示200µm。
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