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.2012年8月17日；150(4):725-37.
doi:10.1016/j.cell.2012.06.038。

造血转录因子GATA1标记组织特异性有丝分裂

斯蒂芬·卡道克 1, 马赫希·乌杜加马, Jan M Pawlicki先生, Jordan C Achtman公司, 迪普蒂·P·贾恩, 永成, 罗斯·C·哈迪逊, 格尔德·A·布洛贝尔
附属公司

造血转录因子GATA1标记组织特异性有丝分裂

斯蒂芬·卡道克等。 单元格. .

摘要

组织特异性转录模式在整个细胞分裂过程中保持不变，以保持谱系保真度。我们研究了转录因子GATA1在转录短暂沉默时是否通过有丝分裂传递造血基因表达程序。活体细胞成像显示，部分GATA1局部滞留在有丝分裂染色质内。高纯度有丝分裂细胞的ChIP-seq发现，在有丝分裂过程中，关键的造血调节基因被GATA1占据。GATA1协同调节子FOG1和TAL1与有丝分裂染色质分离，表明GATA1起着有丝分裂后募集的平台作用。与GATA1分离的基因相比，有丝分裂的GATA1靶基因在进入G1后往往会更快地重新激活。有丝分裂特异性破坏GATA1可选择性延迟有丝分裂期间保留GATA1的基因的重新激活。这些研究表明，GATA1需要有丝分裂“书签”才能通过细胞分裂忠实地传播细胞类型特异性转录程序。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者贡献：SK、MU、JMP、JCA进行了实验；SK、DPJ、YC进行了计算分析；SK、RCH和GAB构思了这项研究并撰写了手稿。

数字

图1
图1。红细胞中GATA1与有丝分裂染色体的局部共定域
A.对暴露于Hoechst活染色的表达YFP-GATA1-ER的活的非同步细胞进行共焦显微镜观察。将单个细胞的图像裁剪为300×300像素。B.中期代表性细胞的YFP-GATA1-ER定位定量分析，如图a中间。染色体内和染色体外区域（棕色，分别覆盖在中间和右侧）和GATA1病灶（白色，覆盖在下部）的定义如文中所述。注意GATA1病灶与染色质共定位。
图2
图2。有丝分裂红细胞的纯化
A.净化方案（右）。在未经处理或诺克唑阻断的G1E细胞（左上角）中测量DNA含量和H3S10ph。注意，诺克唑治疗人群中有丝分裂细胞的不完全富集（~66%）。H3S10ph富集的有丝分裂细胞纯化至>98%（左下）。由于H3S10ph标记足以检测有丝分裂细胞，因此在分类实验中省略了碘化丙胺（PI）。百分比表示代表性实验的有丝分裂指数。FSC-A，前向散射（细胞大小）。B.抗H3S10ph和DAPI染色细胞的IF证实，只有在细胞分选后，诺克唑处理后，有丝分裂细胞才具有高纯度。C.ChIP实验表明，在分类但非未分类的诺卡唑处理细胞中，pol2与高转录看家基因完全分离。抄送4，阴性对照。D–F、ChIP使用对照IgG、抗组蛋白H3和抗RbBP5作为对照。误差条表示SEM(n个= 3).
图3
图3。GATA1在间期和有丝分裂中的全基因组分布
A.GATA1 ChIP-seq在间期和有丝分裂中的分布，在间期或有丝分裂（左）或仅间期（右）出现峰值。B.仅在间期（I-OS，蓝色）、有丝分裂（M-OS，红色）或两者（IM-OS，紫色）中具有GATA1结合位点的比例。C.I-OS、IM-OS或M-OS峰的基序富集分析。I-OS和IM-OS中排名靠前的基序是GATA1共识基序MA0035.2。注：M-OS未显示GATA1共识（WGATAR）基序的显著丰富。D.关键I-OS和IM-OS处E14.5原代胎肝成红细胞的抗-GATA1 ChIP-qPCR。左面板，原始数据绘制为输入DNA的分数。右侧面板，将相同的数据（除了阴性位点）重新绘制为GATA1相间结合的标准化数据，并添加对照IgG进行比较。请注意，有几个网站(盖特1−0.6,加塔2−2.8）相对较低的信号仍显示出明显的IgG富集。误差条表示SEM（n=3）。
图4
图4。有丝分裂GATA1占有率的功能注释揭示了组织特异性调控基因附近位点的偏好性
A.相对于最近的注释转录起始位点（TSS）的峰的分布。I-OS和IM-OS，但非M-OS经常出现在近端启动子（绿色，从饼图中分离出来）。“近端启动子”，TSS上游≤3 kb；“直接下游”，距离转录终止位点≤3kb。B–C类。使用GREAT对I-OS（B）和IM-OS（C）进行功能分析。显著丰富的基因本体类别按其首要功能主题手动分组。x轴显示二项式原始（未校正）p值（对数刻度）。请注意，I-OS与多种过程相关的本体论相关，而IM-OS与红细胞生成和巨核生成的特定缺陷相关。还要注意的是，红细胞和巨核细胞共享大量组织特异性核因子，这可能是巨核细胞主题类别混合的原因（见表S1）。D.GATA1标记了关键的红系转录因子。
图5
图5。有丝分裂期间GATA1结合位点的GATA1辅因子占有率和DNaseI敏感性
A–D。ChIP-qPCR使用异步细胞的指示抗体，其中>97%处于间期（蓝色）或纯化有丝分裂（红色）诱导的G1E-ER4细胞。引物询问了I-OS、IM-OS和阴性对照位点（阴性）。E.G1E细胞在I-OS和IM-OS间期和有丝分裂期间或组分敏感（Pos）和不敏感（Neg）控制位点的DNaseI敏感性分析。左侧面板：将异步G1E（−GATA1）细胞与E2诱导的G1E-ER4细胞（+GATA1。注意到DNaseI敏感性在GATA1激活后显著增加血红蛋白-b1,涤罪所,Slc4a1系列,Zfpm1型、和Klf1公司基因。右侧面板：异步（蓝色）和纯化有丝分裂（红色）E2诱导的G1E-ER4细胞（+GATA1）。请注意，即使在有丝分裂期间GATA1分离的I-OS，有丝分裂也基本保持敏感性。所有误差条表示SEM(n个= 3).
图6
图6。有丝分裂过程中GATA1基因的快速转录激活
A.YFP-MD（左）或YFP-MD（R42A）（右）强度的流式细胞术作为DNA含量的函数。注意MD而不是MD（R42A）导致有丝分裂破坏。B.流式细胞术如A）所示，用诺卡唑处理并释放0h、2h、4h或6h的细胞显示G1细胞逐渐积聚。红色方框表示用于收集细胞进行前mRNA（PT）RT-qPCR分析的门。在G1E-ER4细胞中由GATA1在间期和有丝分裂中结合的基因的C.PT RT-qPCR（上图）或仅在间期（下图）。数据绘制为设置为1的异步单元（Async）中稳态水平的一部分。误差条显示SEM(n个= 3).
图7
图7。GATA1的有丝分裂特异性破坏延迟了标记基因的重新激活
答：IF图像显示MD标记的GATA1结构在中期-后期转换中被破坏，而不是MD（R42A）标记的GADA1结构。所有显示的细胞都有类似的GFP表达，表明类似的稳态MD-GATA1-ER水平。B.全细胞裂解物的Western blot显示MD-GATA1-ER和MD（R42A）-GATA1-ER表达与内源性GATA1水平相当（与图S1B相比）。C.表达MD-GATA1-ER（绿色）和MD（R42A）-GATA1-ER（灰色）的G1E细胞的PT-RT-qPCR分析。MD（R42A）-GATA1-ER与GATA1-ER类似地重新激活书签基因（与图6C相比）。GATA1的有丝分裂破坏延迟了GATA1在有丝分裂中占据的基因的重新激活，但不影响有丝分裂期间空出的基因的再激活。数据绘制如图6C所示。误差条表示SEM和n个= 6. D.与未感染的G1E细胞相比，表达指示结构的G1E电池中的基因表达水平绘制为折叠抑制。E.Kit表面表达的流式细胞术显示MD-GATA1-ER未能完全抑制Kit表达。左：平均荧光强度；右图：代表性实验中Kit检测的直方图。所有误差条表示SEM和n个RT-qPCR和FACS为3。
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