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.2013年1月15日:206-17。
doi:10.1016/j.ymben.2012.07.008。 Epub 2012年8月8日。

Myc诱导B细胞代谢重编程的同位素非平稳13C通量分析

附属公司

Myc诱导的B细胞代谢重编程的同位素非平稳13C通量分析

泰勒·A·墨菲等。 Metab工程. 2013年1月.

摘要

我们评估了几种(13)C代谢通量分析(MFA)方法,发现同位素非稳态MFA在培养的P493-6 B细胞中实现了最大通量分辨率,这些细胞已被设计用于提供Myc癌蛋白的可调表达。在致癌(高)和内源性(低)Myc表达水平下获得的代谢通量图的比较表明,异位Myc表达导致了网络范围的重编程。高Myc细胞比低Myc细胞更依赖线粒体氧化代谢,全球范围内上调了其相对于葡萄糖的氨基酸消耗。与葡萄糖摄取和乳酸排泄的适度增加相比,TCA循环和角代谢线粒体途径在High Myc细胞中的通量增加了2-4倍。由于我们的MFA方法完全依赖于蛋白质结合氨基酸和RNA结合核糖的同位素测量,因此它很容易适用于更复杂的肿瘤模型,这些模型不适合直接提取和对游离细胞内代谢物进行同位素分析。

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数字

图1
图1。MFA研究设计概述
混合物13将C标记的葡萄糖示踪剂喂入在高或低Myc条件下生长的P493-6。在整个指数期的不同时间点测量细胞外介质浓度和细胞内代谢物标记。通过最小化模拟和测量标记数据与细胞外通量测量之间的拟合不足,应用计算模型绘制通量图。
图2
图2。选定GC-MS片段离子的标记动力学
所示GC-MS离子用于丙氨酸(ALA)、甘氨酸(GLY)、丝氨酸(SER)、天冬氨酸(ASP)、谷氨酸(GLU)和核糖(RIB)。每个面板都显示了实验测量的质量同位素丰度(数据点)和INST-MFA模型拟合(实线),用于在(A)高或(B)低Myc条件。原始质量同位素数据未经天然同位素丰度校正。
图3
图3。P493-6在(A)高Myc和(B)低Myc条件下测定的B细胞通量图
净通量单位为nmol/106单元格/小时。通量表示为M±SE,哪里M(M)是95%通量置信区间的中位数东南方是估计的标准误差M(M)计算公式为(UB95–LB95)/3.92。(UB95和LB95分别是95%置信区间的上限和下限。)箭头厚度与净流量成比例。为了提高清晰度,图中没有显示同位素模型中包含的一些通量。
图4
图4。替代MFA方法测定的高Myc条件下的细胞内通量
基于在高Myc条件下获得的12个中心代谢通量,对三种通量估算方法进行了比较(SS w/核糖=稳态,包括核糖测量)。误差条表示通量估计值的95%置信区间,绘制的值表示置信区间的中位数。选择显示的通量是因为它们的置信区间在三种方法中表现出最大的变异性。(A)PP途径净通量:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、核酮糖-5-磷酸差向异构酶(R5PE)、核酮糖-5-磷酸异构酶(R5PI)、转酮醇酶1(TK1)和转醛酶2(TA2)。(B)TCA循环和角代谢净通量:丙酮酸脱氢酶(PDH)、异柠檬酸脱氢酶。
图5
图5。高、低Myc条件下P493-6细胞的摄氧速率
吸氧速率以nmol/10为单位进行测量6单元格/小时。在未经处理的细胞(n=11)或用100 nM鱼藤酮处理的细胞中(n=2)测定比率。误差条表示平均值的标准误差。显著性通过双尾Student t检验确定,p<0.05。

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引用人

工具书类

    1. Ahn WS,Antoniewicz MR.使用同位素示踪剂和质谱法对CHO细胞在生长期和非生长期的代谢通量进行分析。Metab Eng.2011;13:598–609.-公共医学
    1. Antoniewicz MR、Kelleher JK、Stephanopulos G.通过稳定同位素测量估算的代谢通量置信区间的测定。Metab Eng.2006;8:324–37.-公共医学
    1. Antoniewicz MR、Kelleher JK、Stephanopulos G.代谢通量分析中氨基酸质量同位素分布的准确评估。分析化学。2007年a;79:7554–7559.-公共医学
    1. Antoniewicz MR、Kelleher JK、Stephanopulos G.基本代谢物单位(EMU):同位素分布建模的新框架。Metab Eng.2007b;9:68–86.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Antoniewicz MR,Kelleher JK,Stephanopulos G.采用气相色谱/质谱法测量葡萄糖氢原子的氘富集度。分析化学。2011;83:3211–6.-项目管理咨询公司-公共医学

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