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.2012年11月；143（5）：1330-1340.e1。
doi:10.1053/j.gastro.2012.07.099。 Epub 2012年7月27日。

Toll样受体2介导的肠损伤和肠肿瘤坏死因子受体I参与小鼠肝纤维化

菲利普·哈特曼 1, 迈克尔·海默尔 1, 马格达莱娜·马扎戈娃 1, 大卫·A·布伦纳 1, 伯恩德·施纳布尔 2
附属公司

Toll样受体2介导的肠损伤和肠肿瘤坏死因子受体I参与小鼠肝纤维化

菲利普·哈特曼等。 胃肠病学. 2012年11月.

摘要

背景和目标：实验模型中肝纤维化的进展取决于肠道衍生细菌产物，但对粘膜屏障破坏或移位的机制知之甚少。我们使用胆汁淤积性肝病小鼠模型来研究肝损伤后肠屏障破坏的机制。

方法：在胆管结扎后的Toll样受体2（TLR2）缺陷和肿瘤坏死因子受体I（TNFRI）缺陷小鼠中评估肝纤维化和细菌移位。分离上皮细胞和固有层细胞，并通过免疫印迹分析和流式细胞术进行分析。我们分析了骨髓嵌合体和带有TNFRI受体条件获得功能等位基因的小鼠。通过将TNFRI（flxneo/flxneo）小鼠与在肠上皮细胞中特异表达VillinCre转基因的小鼠杂交，我们创建了在肠上皮上皮细胞上特异表达功能性TNFRI的小鼠（VillinCRTNFRI，flxneo/flxnewo）小鼠）。

结果：在胆管结扎后，TLR2缺陷小鼠的肝纤维化和细菌及细菌产物的肠道移位少于野生型小鼠。具有不表达TLR2的造血细胞的小鼠也减少了细菌移位，表明造血细胞表达TLR2调节肠屏障功能。胆道结扎后野生型小鼠小肠固有层产生肿瘤坏死因子α的TLR2（+）单核细胞数量增加；TNFRI介导的肠上皮细胞信号促进了细菌移位。

结论：肠道炎症和细菌移位通过小鼠固有层单核细胞上的TLR2信号和肠上皮细胞上的TNFRI信号促进肝纤维化。因此，肠道TNFRI是淤胆性肝纤维化的重要介质。

PubMed免责声明

利益冲突声明

没有一位作者有财务、个人或职业利益冲突需要披露。

数字

图1
图1。TLR2肝纤维化减轻−/−老鼠
野生型和TLR2−/−小鼠接受假手术（n=4）或胆管结扎（BDL；n=8-13），持续指定时间。使用qPCR评估肝脏中（A和B）胶原α1（I）mRNA的表达。（C和D）肝纤维化通过天狼星红染色进行评估，并通过形态计量分析进行量化。比例尺=50μm。（E和F）通过qPCR测定肝脏TIMP-1和TGF-β1mRNA水平*p<0.05。
图2
图2。TLR2级−/−小鼠结扎胆总管后细菌移位较少
（A） 培养肠系膜淋巴结中的需氧菌并进行定量（MLN；n=10-12）；CFU=菌落形成单位。（B和C）测定血浆内毒素（假手术组n=4，胆管结扎组n=8-21）。表达（D–E）GFP大肠杆菌在一天前进行假手术或BDL手术的BALB/c小鼠的肠循环中注射。注射后4小时培养MLN（D；小肠n=4，盲肠n=17，结肠n=28）。阳性培养物荧光显微镜显示GFP表达。表达GFP的图像大肠杆菌如阳性对照所示（E）。（F） GFP移位-大肠杆菌在野生型（n=4）和TLR2中评估从结肠环到MLN−/−BDL后一天，小鼠（n=5）*p＜0.05。
图3
图3。细菌易位依赖于造血细胞的TLR2信号
（A和B）在胆管结扎（BDL）后一天，对肠系膜淋巴结培养物（n=8–23）中的集落形成单位（CFU）进行计数，并对野生型和TLR2骨髓嵌合体小鼠的血浆内毒素（n=4–15）进行测定。（C） TLR2级+，细胞内TNFα+（n=4-5个独立实验），以及TLR2+，IL-6+CD45.2的表达（n=3个独立实验）+，CD11b+，Lys6C+细胞，在野生型小鼠结肠固有层进行评估。在每项独立实验中，将三只小鼠的固有层细胞合并。（D） 在野生型和TLR2的分离结肠上皮细胞中评估RhoA、磷酸化MLC和微管蛋白的表达−/−老鼠。显示了具有代表性的蛋白质印迹。（E） 野生型和TLR2肠段中闭锁素、克劳丁-4和ZO-1蛋白的表达−/−用免疫荧光和westernblot分析小鼠。显示了3-4个独立实验的代表性荧光图像。比例尺=1μm*p<0.05。
图3
图3。细菌易位依赖于造血细胞的TLR2信号
（A和B）在胆管结扎（BDL）后一天，对肠系膜淋巴结培养物（n=8–23）中的集落形成单位（CFU）进行计数，并对野生型和TLR2骨髓嵌合体小鼠的血浆内毒素（n=4–15）进行测定。（C） TLR2级+，细胞内TNFα+（n=4-5个独立实验），以及TLR2+，IL-6+CD45.2的表达（n=3个独立实验）+，CD11b+，Lys6C+细胞，在野生型小鼠结肠固有层进行评估。在每项独立实验中，将三只小鼠的固有层细胞合并。（D） 在野生型和TLR2的分离结肠上皮细胞中评估RhoA、磷酸化MLC和微管蛋白的表达−/−老鼠。显示了一个具有代表性的western blot。（E） 野生型和TLR2肠段中闭锁素、克劳丁-4和ZO-1蛋白的表达−/−用免疫荧光和westernblot分析小鼠。显示了3-4个独立实验的代表性荧光图像。比例尺=1μm*p<0.05。
图4
图4。TNFRI公司−/−胆管结扎后保护小鼠免受肝纤维化的影响
野生型和TNFRI−/−假手术（n=4）或胆管结扎（BDL；n=9-13）（A）用qPCR检测肝胶原α1（I）mRNA。（B和C）胶原沉积通过天狼星红染色进行评估，并通过图像分析进行定量。比例尺=50μm。（D和E）肝脏TIMP-1和TGF-β1基因表达通过qPCR进行评估*p<0.05。
图5
图5。非造血细胞TNFRI介导细菌易位
（A） 培养肠系膜淋巴结中的需氧菌并进行定量（n=7–10）；CFU=菌落形成单位。（B和C）测量血浆内毒素水平（假手术组n=4，胆管结扎组n=6-10）。（D） western blotting分析分离的肠上皮细胞中RhoA、磷酸化MLC和微管蛋白的表达。图像代表了至少四个独立的西方斑点。（E） 在结肠切片上进行免疫荧光染色或western blotting检测闭塞素、克劳丁-4和ZO-1。显示了3-4个独立实验的代表性图像。比例尺=1μm*p<0.05。
图6
图6。TNFRI对肠上皮细胞的激活与肝纤维化
（A） TNFRI对VilinCreTNFRI离体结肠上皮的再激活作用flxneo/flxneoPCR分析（左面板）。各小鼠的尾巴作为对照（右侧面板）。（B–D）野生型，TNFRIflxneo/flxneo和VillinCreTNFRIflxneo/flxneo小鼠接受假手术（n=3-4）或胆管结扎（BDL；C57BL/6 n=6，TNFRI n=9-10flxneo/flxneo以及VillinCreTNFRIflxneo/flxneo老鼠）。（B和C）胶原沉积通过天狼星红染色进行评估，并通过图像分析进行定量。比例尺=50μm。（D） 测定血浆内毒素水平*p<0.05。
图7
图7。胆汁淤积性肝病细菌移位模型的建立
淤胆性肝损伤后TLR2+肠固有层的单核细胞被激活并产生TNFα。TNFα与肠细胞上的TNFRI结合，激活RhoA/MLC通路，导致紧密连接中断。细菌和细菌产物（如LPS）穿过粘膜屏障，通过门脉循环到达肝脏。LPS与肝星状细胞（HSC）上的TLR4结合，导致肝纤维化。
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