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.2012年12月；69(23):4017-27.
doi:10.1007/s00018-012-1064-8。 Epub 2012年7月8日。

MicroRNA-338调节氧化磷酸化机制的多核编码线粒体mRNAs编码亚单位的轴突表达

阿玛兹·阿斯克拉菲 1, 阿马尔·N·卡尔, 奥兰吉·纳特拉尼奥, 玛格丽特·麦克吉本尼, 安东尼·乔治奥, 巴里·卡普兰
附属公司

MicroRNA-338调节氧化磷酸化机制的多核编码线粒体mRNAs编码亚单位的轴突表达

阿玛兹·阿斯克拉菲等。 细胞分子生命科学. 2012年12月.

摘要

微RNA（MicroRNAs，miRNAs）是一类新型的非编码小RNA，起着基因表达的转录后调节器的作用。值得注意的是，这些小分子可以协同调节编码相关细胞功能蛋白质的多个基因。此前，我们报道了脑特异性miR-338调节细胞色素c氧化酶IV（COXIV）的轴突表达，COXIV是一种核编码的线粒体蛋白，在氧化磷酸化和轴突功能中发挥关键作用。在这里，我们报告了ATP合成酶（ATP5G1），像COXIV mRNA一样，包含一个假定的miR-338结合位点，并且轴突中miR-339水平的调节导致COXIV和ATP5G2表达的改变。重要的是，miR-338对局部COXIV和ATP5G1表达的调节对轴突ROS水平以及轴突生长有显著影响。这些发现指出了miR-338通过协调调节轴突中多核编码线粒体mRNA的表达来调节局部能量代谢的机制。

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图1
图1
miR-338靶向大鼠ATP5G1。一推测大鼠ATP5G1和COXIV 3'UTR中的miR-338结合位点。通过多重二级结构分析确定了ATP5G1 3'UTR的二级结构。COXIV 3'UTR二级结构改编自Aschrafi等人[15]。miR-338目标位点如所示灰色大鼠ATP5G1和COXIV 3'UTR中推测的miR-338结合位点序列：靶位点的种子序列为粗体.b条–e（电子）miR-338调节SCG神经元轴突中ATP5G1的表达。转染SCG神经元的远端轴突和细胞体中核编码线粒体mRNA水平的定量b条25 nM pre-miR-338或c（c）25 nM抗miR-338。转染后16h用qRT-PCR测定mRNA丰度。所有mRNA水平均相对于β-肌动蛋白mRNA表达。误差线代表三个样品的SEM。学生的t吨测试*第页< 0.05, **第页<0.01. 转染SCG轴突的轴突蛋白裂解物的Western blot分析d日前miR-338或e（电子）抗miR-338。β-actin作为负荷对照。NT，非靶向寡核苷酸。用ImageJ定量轴突蛋白裂解物。定量显示，在miR-338的影响下，ATP5G1蛋白水平发生了显著变化。数值代表平均值±SEM。学生的t吨测试**第页< 0.01; ***第页<0.001
图2
图2
调节轴突ATP5G1表达改变ROS的产生。一miR-338介导远端轴突中ROS的产生。用pre-miR-338或非靶向寡核苷酸（NT）转染远端轴突。使用羧基-H荧光显微镜测量miRNA处理的轴突中的异体内ROS水平2DCFDA公司(绿色)和线粒体(红色). NDGA是一种有效的抗氧化剂，用于抑制miR-338介导的ROS在轴突中的生成。b条使用ImageJ对荧光强度进行量化，并将荧光水平表示为相对荧光单位（RFU）。数据为35-45个轴突测量值的平均值±SEM。学生的t吨测试***第页 < 0.0001.c（c）氧嘌呤醇被用来抑制线粒体外黄嘌呤氧化酶生成的活性氧的形成。e（电子）用抗miR-338或NT-寡核苷酸转染远端轴突。如上所述在轴突中测量ROS。比例尺，20微米。b、 d、f定量miR-338介导的轴突ROS水平诱导。箭头表明线粒体相关活性氧。数值代表平均值±SEM。学生的t吨测试**第页 < 0.01; ***第页 < 0.001
图3
图3
轴突miR-338水平升高会减弱交感神经元中轴突的生长。一培养3天的SCG神经元的远侧轴突和位于分隔培养物侧面的轴突的显微照片被转染25 nM pre-miR-338或25 nM对照pre-miR-NT 24小时。箭头指出生长锥的位置。比例尺：100微米。b条用pre-miR-338或NT-oligonnucleotides和c（c）抗miR-338或NT对照24小时。转染后测量轴突长度。数据为35-45个轴突测量值的平均值±SEM。实验重复了三次，结果相似。学生的t吨测试***第页 < 0.0001
图4
图4
与单个mRNA的敲除相比，ATP5G1和COXIV水平的敲除共同导致轴突中ROS的增加和ATP水平的降低。一用靶向ATP5G1 mRNA或COXIV mRNA的siRNA寡核苷酸（25 nM）或两者同时转染SCG神经元（7-DIV）。使用ViaLight评估ATP水平®Lonza的Plus套件。数值以任意发光单位绘制。数据表示平均值±SEM；单向方差分析**第页 < 0.001.b条敲除轴突COXIV和ATP5G1表达增加了轴突中的ROS水平。将靶向COXIV mRNA或ATP5G1 mRNA或两者的siRNA寡核苷酸（25 nM）转染SCG神经元（7 DIV）。使用羧基-H通过荧光显微镜测量siRNA处理的轴突中的轴突内ROS水平2DCFDA公司(绿色)和线粒体(红色). 数值以任意荧光单位绘制。数据表示平均值±SEM；单因素方差分析**第页 < 0.001.比例尺：50微米
图5
图5
与单个mRNA的敲除相比，轴突ATP5G1和COXIV mRNAs的敲除显示轴突外生长的减少更大。一SCG神经元培养3天，然后用靶向COXIV mRNA或ATP5G1 mRNA或两者的siRNA寡核苷酸（25 nM）转染远端轴突。箭头指出轴突末端区域的位置。比例尺：200微米。b条转染16小时后，在分隔培养物的侧面测量轴突。数据是30–40个轴突测量的平均值±SEM。实验重复了三次，结果相似。单向方差分析***第页 < 0.0001
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