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.2012年8月；139(15):2821-31.
doi:10.1242/dev.079939。 Epub 2012年6月28日。

果蝇microRNAs条件表达的全基因组转基因资源

费尔南多·贝贾拉诺 1, 黛安·博托拉米奥尔·贝塞特, 齐代, 孙开良, 阿比尔·萨伊, 余廷周, 大卫·R·罗利, 凯文·金, 倪建全, 洪端, 杨仕娟（Jr-Shiuan Yang）, 都铎A富尔加, 大卫·范·瓦克托, 诺伯特·佩里蒙, 埃里克·C·莱
附属公司

果蝇microRNAs条件表达的全基因组转基因资源

费尔南多·贝贾拉诺等。 开发. 2012年8月.

摘要

microRNAs（miRNAs）是一种内源性短RNAs，可调节大量转录后基因调控网络。虽然计算搜索和实验分析为单个miRNAs的数百个功能靶点提供了证据，但此类数据很少能清楚地揭示在体内操纵miRNAs的表型后果。我们描述了一个包含165个果蝇miRNA转基因的全基因组集合，发现大多数果蝇都会诱发特定的发育缺陷，包括无数细胞吞噬和模式化基因中突变体的现象拷贝。这种联系使我们能够验证miRNA诱导表型的几个可能靶点。重要的是，这些表型中很少能从计算预测的目标列表中预测出来，因此突出了miRNA活性的全动物读数的价值。最后，我们提供了一个例子，说明这些数据与miRNA功能丧失条件的相关性。尽管几个K盒miRNA的错误表达抑制了Notch通路的活性，但与miRNA海绵的相互遗传交互试验表明，K盒miRNA家族在限制Notch信号传导方面发挥了内源性作用。总之，我们提供了大量证据表明，单个miRNAs的错误表达通常会诱导特定的突变表型，从而指导其功能研究。此外，这些数据表明，在疾病状态下，放松对其他动物个体miRNAs的调控可能经常产生相对特定的表型。

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数字

图1。
图1。
Gal4-UAS二进制系统用于激活的miRNA转基因的系统体内筛选。我们收集了两组UAS-miRNA转基因，一组包含在P元件主干中的随机插入（165个不同的转基因包含149个不同miRNA发夹），另一组包含attP登陆位点中的定义插入（106个不同的基因包含108个不同的miRNA发卡），包括独立位点，miRNA簇和细分簇。这些收藏品具有互补的实验优势。我们将这些与各种普遍存在的和组织特异性Gal4驱动因子交叉，以系统评估异位miRNA活性的后果。Gal4驱动器模式的示例显示在左侧翼内成像盘（A-C）上，其中lacZ公司或GFP公司记者由代表性Gal4插入物驱动；用DAPI复染A′-C′show reporter堆积。(A类,A′)ptc-镀锌4活跃于前部（a）和后部（p）室的边界。(B类,B′)bx-Gal4型活跃于整个翼囊，但在背侧（d）相对于腹侧（v）室升高，沿假定翼缘（wm）不活跃。(C类,C′)sd-gal4型在整个翼囊中更加均匀地活动。
图2。
图2。
图案缺陷的多样性可以在果蝇属机翼。图中所示为野生型（A）和突变型（B-K）成虫翅膀，说明了主要的突变表型类别。产生这些表型的途径活性的方向性在每个面板的右上角注明。(A类)正常的翅膀具有特征性的大小和形状，以及可复制的图案元素，例如五个纵向翼脉（L2-L5被标记）和装饰翅膀前缘的感觉鬃毛。(B类)由Notch通路中转录因子的突变克隆引起的翼切口，苏（H）. (C类)击倒刺猬配体导致翅膀缺失。(天,E类)Notch通路目标表达错误导致的翼静脉损失示例E（spl）米γ（D）或BMP配体的敲除dpp（数据处理程序）（E） ●●●●。(F类)高水平表达Notch通路成分导致的厚静脉神经化的. (G公司)活化MAP激酶的表达翻滚（Sevenmaker，Sem）引起异位翼静脉。(H（H）,我)具有多种突变表型的翅膀示例。星号表示机翼切口区域。（H） 击倒苏（H）诱导厚脉和翼切口。（一） 激活的BMP受体tkv-QD的错误表达会导致厚静脉和异位静脉。(J)河马途径成分的敲除扩大在翅膀的中央区域导致过度生长（箭头）。(K（K）)Hedgehog受体Smoothed（SmoDN）显性阴性版本的表达导致L3-L4结构域的缺失。
图3。
图3。
miRNA诱导的翅膀表型的选定示例说明了UAS-DsRed-miRNA转基因的一般特性。(A类,B类)杂合子的翅膀bx-镀锌4(‘bx公司’）雌性（A）和半合子雄性（B）；雄性比雌性小，这就是体型差异的原因。(首席财务官)剂量效应示例。静脉增厚（箭头）mir-263b型在以下方面较弱bx-镀锌4雌性（C）比雄性（D）。翼切口（星号）由mir-977在以下方面较弱sd-Gal4公司(标准偏差)雌性（E）比雄性（F）。(G-I公司)在不同的Gal4背景中，miRNA的错误表达表型不同。（G）bx/Y>mir-7显示出巨大的静脉增厚（箭头），但边缘是连续的。（H）sd/Y>mir-7显示出巨大的翅膀缺口（星号），只有轻微的叶脉增厚。（一）ptc-Gal4>mir-7在L3-L4结构域（箭头）中表现出远侧机翼切口和减少。(J,K（K）)miRNA簇的解剖。（J） 激活mir-11/mir-998操纵子诱导静脉（箭头）和交叉静脉（箭头形）丢失；这些表型被异位重复mir-11（K） ●●●●。(L（左）)种子科的相似性；mir-2型与属于同一家族密尔-11也会导致静脉丢失（箭头）。
图4。
图4。
不同基因表达错误导致的翅膀表型总结果蝇属miRNA。图中显示的是成年雌性翅膀，但X染色体连接的Gal4驱动器除外（/X=雌性；/Yμ雄性）。(A-E公司)除了野生型[w1118型]翅膀（A），所有其他苍蝇都含有Gal4和UAS-DsRed-miRNA转基因的单一拷贝。（B）bx-镀锌4/X杂合子雌性也有正常的翅膀sd-Gal4/X公司雌性（未显示）。（C） Gal4活性sd-Gal4/年雄性会导致后翼缘的轻微损失，尤其是在翼铰链附近（a和C中的方框区域在D和E中分别扩大）。(F-J公司)不同miRNAs诱导的静脉丢失示例。(K-T公司)不同miRNAs诱导的静脉增厚示例。(U-AA公司)不同miRNAs诱导的翅膀切口示例。请注意，P-S和U-X分别强调了诱导静脉增厚或边缘丢失的miRNAs，这取决于驱动因素。其他表型组合可通过检查发现。(星期二至星期四)不同miRNAs诱导的异位翼静脉（箭头）示例。(EE-OO（电气-操作）)对翼缘鬃毛具有选择性作用的miRNAs示例；JJ-OO显示了前缘的特写。(聚丙烯)ptc-镀锌4杂合女性；ptc+域包括由双箭头标记的L3-L4区域。(QQ-UU（质量-单位）)诱导L3-L4结构域过度生长的miRNA示例。(VV-ZZ公司)诱导林下生长或L3-L4结构域缺失的miRNA的实例。(AAA-EEE公司)诱发翅膀水泡的miRNAs示例。(自由现金流)沿前后轴诱导潜在缺陷的miRNA。(GGG公司)诱导潜在近端缺陷的miRNA。(HHH-OOO公司)不同miRNA诱导的其他严重翅膀畸形或翅膀缺失的例子。
图5。
图5。
直接靶向miRNAs的验证突然的. (A类)靶向扫描预测突然的3英尺UTR。（B-D）成年雌性翅膀。(B类)可行的突变的[1]突变体显示L5翼静脉远端缺失（箭头所示）。(C类)错误表达let-7即使在低温下培养也会导致翅膀变形，从而限制Gal4的活性；此外，还可以看到L5远端区域的缺失（箭头所示）。(天)错误表达mir-275/mir-305也会导致L5的丢失。(E-G〃)携带盆状GFP突变3′UTR，dpp-Gal4和UAS-Ds红色（与F-G〃中的miRNA相连）；翼囊的中央区域如图所示。（E-E〃）对照染色显示DsRed的表达不抑制突变传感器。（F-F〃）异位let-7强烈抑制突然的传感器。（G-G〃）异位miR-275轻度抑制突然的传感器。(H（H）)雷尼拉·布鲁普3′UTR公司S2细胞中的传感器测定。与体内结果一致，mir-275型弱抑制了突然的传感器，同时let-7强烈压抑它；mir-iab-4型已经过验证，可以抑制突然的3′UTR（Okamura等人，2008）。数据为平均值±标准误差。
图6。
图6。
K盒miRNA海绵在翅膀发育过程中增强Notch信号。（A、C-H）槽口[55e11]/+(N个/+)携带ptc-镀锌4和两份显示的miRNA海绵（SP）；scr，加扰海绵控件。(A类)N个/+表达对照海绵的雌性在末端出现缺口（星号），静脉轻度增厚；这些区域被放大以突出这些表型。(B类)图中所用海绵的错误表达并没有改变翅膀的发育；ptc-Gal4>2xmir-13aSP如示例所示。放大的镶嵌物显示出正常的静脉厚度，可以用来判断N个/+单倍不足。(C类)miR-13aSP获救后的错误表达N个/+切口，但不是脉增厚。(天)miR-7SP的错误表达也没有拯救N个/+表型。星号表示机翼切口区域。(E-H公司)放大远端翼梢，以突出其他海绵背景中翼切口的状态。星号表示机翼切口区域。（E） miR-2bSP、（F）miR-2cSP和（G）miR-13bSP均获救N个/+缺口，但（H）miR-6SP不能（星号）。(我)对不同基因型的翅膀切口的挽救进行量化。N个/+在各种ptc-Gal4>UAS-mir-SP大约三分之二的动物出现了背景缺口，在miR-2cSP存在的情况下，缺口减少到20%以下，在miR2bsP和miR-13aSP中减少到10%，在miR13bSP中减少至2%以下。插图显示了这些K盒miRNAs的序列关系。
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