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.2012;7（6）：e39115。
doi:10.1371/journal.pone.0039115。 Epub 2012年6月15日。

NAD合成酶家族中谷氨酰胺与氨的利用

杰西卡·德·英格尼伊斯 1, 马拉·D·卡扎诺夫, 康斯坦丁·沙塔林, 米哈伊尔·盖尔芬德, 安德烈·奥斯特曼, 莱昂纳多·索尔奇
附属公司

NAD合成酶家族中谷氨酰胺与氨的利用

杰西卡·德·英格尼伊斯等。 公共科学图书馆综合版. 2012.

摘要

NAD是一种普遍存在且必不可少的代谢氧化还原辅因子，在某些调节途径中也作为底物发挥作用。NAD合成的最后一步是NAD合成酶（NADS）对脱酰胺-NAD的依赖性ATP酰胺化。NADS家族的成员几乎存在于三个生命王国的所有物种中。在真核NADS中，核心合成酶结构域与为反应提供氨的类似于硝化酶的谷氨酰胺酶结构域融合。这种双域NADS排列使得谷氨酰胺可以作为氮供体被利用，也存在于各种细菌谱系中。然而，NADS家族的许多其他细菌成员不包含谷氨酰胺酶结构域，它们在体外只能利用氨（而不能利用谷氨酰胺）。几乎所有古生菌都具有单域NADS的特征，这里证明了jannaschi甲烷球菌的代表性酶对氨的依赖性。然而，关于NADS家族单结构域成员的实际体内氮供体的问题仍然悬而未决：谷氨酰胺是像大多数依赖ATP的酰胺转移酶那样被一个固定的（但未知的）谷氨酰胺酶亚基水解，还是像谷氨酰胺合成酶那样被游离氨水解？在这里，我们通过将NADS家族的进化分析与两个代表性细菌系统的实验特征相结合来解决这个难题：嗜热Thermus的两个亚单位NADS和鼠伤寒沙门氏菌的单域NADS提供了氨（而非谷氨酰胺）的证据是典型单域NADS的生理底物。后者代表了NADS最有可能的祖先形式。利用谷氨酰胺的能力似乎是通过谷氨酰胺酶亚基的补充以及细菌早期分支中的结构域融合而进化而来的。NADS家族的进一步进化包括两种替代形式之一的谱系特异性丢失和水平基因转移事件。最后，我们确定了与谷氨酰胺利用能力相关的NADS结构元素。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。NAD合成酶催化的两步反应方案。
图2
图2。功能偶联谷氨酰胺酶（GAT）和合成酶（NADS）组分的基因组排列。
比较基因组分析揭示了GAT和NADS组分的4种不同的基因组排列：a）双结构域组织（融合）；b） 物理聚类；c） 远距离发生；d） 谷氨酰胺酶缺乏。它们在古生菌、细菌和真核生物中的相对分布也如图所示（左侧）。
图3
图3。生物化学特性嗜热杆菌谷氨酰胺酶和NAD合成酶亚基。
Ni-NTA亲和柱（A）和凝胶过滤色谱（B）洗脱组分的SDS页面分析表明，His标记的重组嗜热杆菌NADS和未标记的GAT倾向于共同纯化。（C） 动力学表征嗜热杆菌S-亚单位和G/S复合物。
图4
图4。Nit11和SK51的分析鼠伤寒沙门氏菌突变菌株。
（A） 的示意图鼠伤寒沙门氏菌nadE突变菌株。Nit11突变体的特征是在核苷酸143处发生错义突变，产生氨基酸替代AN。SK51突变体的特点是单核苷酸缺失（位于–51的G被认为是起始密码子的第一个碱基+1），该缺失正好位于启动子-35盒调控区的上游。预测的调控序列显示在底线中。（B） 的相对表达水平nadE（奈德）野生型和两类突变体nit11号机组（S48N）和SK51在四种不同的生长条件下生长：富培养基（1），添加20 mM NH的最小培养基三（2） ，MM补充5 MM（3）或20 MM（4）谷氨酰胺。（C） 野生型和S48N的动力学特征鼠伤寒沙门氏菌NAD合成酶。通过分光光度耦合（SPEC）分析测量初始速率。动力学参数K（K） 米和k个 猫是在固定（饱和）浓度的共基质下测定的表观值。对于固定底物，浓度为：2 mM ATP、2 mM NaAD和40 mM NH三错误表示标准偏差。
图5
图5。NAD合成酶家族的系统发育分析。
（A） 基于合成酶域构建的NAD合成酶系统发育树示意图（完整版本如图S1所示）。NAD合成酶基因的定义类型——“融合”(F型)，“群集”(C型)，“远程”(R型)和“无”(N型)分别以红色、绿色、青色和洋红色突出显示。整个树被拓扑划分为簇，这些簇被指定为I–VII分支。（B） 带有NAD合成酶基因类型映射的物种树示意图（完整版本如图S2所示）。含有单一NAD合成酶基因的F、N、C和R型基因组分别用红色、绿色、青色和洋红表示。拥有一个以上NAD合成酶基因的基因组分为“多个F”、“多个N”、“单个F-单个N”和“所有其他”基因组组，分别以深红色、深绿色、橙色和黄色突出显示。
图6
图6。来自结核分枝杆菌.
大多数相互作用残基存在于以下结构区域，即α9、α18螺旋和延伸的C末端环，分别以粉红色、绿色和黄色突出显示。
图7
图7。NAD合成酶家族单域和双域形式的初步进化场景。
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