Endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) complexes induce phase-separated microdomains in supported lipid bilayers

doi:10.1074/jbc.M112.378646

.2012年8月10日；287(33):28144-51.

doi:10.1074/jbc。M112.378646。 Epub 2012年6月20日。

转运（ESCRT）复合物所需的内体分选复合物在支撑脂质双层中诱导相分离微结构域

伊夫森·波拉¹, 瓦西里·伊万诺夫, 拉尔斯·安德斯·卡尔森, Kiyoshi Mizuuchi公司, 詹姆斯·赫利

附属公司

PMID： 22718754
预防性维修识别码：项目经理3431677
DOI（操作界面）： 10.1074/jbc。M112.378646号

转运（ESCRT）复合物所需的内体分选复合物在支撑脂质双层中诱导相分离微结构域

伊夫森·波拉等。生物化学杂志. 2012.

.2012年8月10日；287(33):28144-51.

doi:10.1074/jbc。M112.378646。 Epub 2012年6月20日。

作者

伊夫森·波拉¹, 瓦西里·伊万诺夫, 拉尔斯·安德斯·卡尔森, Kiyoshi Mizuuchi公司, 詹姆斯·赫利

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院NIDDK分子生物学实验室，邮编：20892。

PMID： 22718754
预防性维修识别码：项目经理3431677
DOI（操作界面）： 10.1074/jbc。M112.378646号

摘要

运输（ESCRT）系统所需的内胚体分选复合体通过一种不寻常的膜芽生反应将泛素化的货物运输到溶酶体，该反应被引导到远离胞浆的方向。在这里，我们展示了人类ESCRT-II在支撑脂质双层上自组装成10-100个分子簇。ESCRT-II簇合物具有功能性，因为它们在膜上以纳米摩尔浓度与泛素和ESCRT-III亚基VPS20结合，在溶液和晶体中观察到相同的化学计量学。只有当胆固醇包含在>10 mol%的脂混合物中时，才会形成簇。簇合物诱导形成有序的膜结构域，排除染料1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚二碳-氰基高氯酸盐。这些结果表明，ESCRT复合物能够在脂质本身不自发相分离的条件下诱导横向脂质相分离。这一特性有助于ESCRT介导的膜出芽。

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数字

**图1。**
**SLB上的ESCRT-II集群。** *A中，*10个米将人ESCRT-II加载到流式细胞中，观察到簇的形成。*B、，*人类ESCRT-II簇大小的直方图由100个簇的量化获得，并划分为20个分子仓。*C、，*PI（3）P绑定FYVE域不会在SLB上形成簇。50牛顿米本实验将GFP-EEA1-FYVE域加载到流动池中。*D、，*酵母ESCRT-II在与A类但与人类ESCRT-II相比，这些簇更小，数量更多。(E类). 人类ESCRT-II在含有PI（3）P的GUV上形成分辨率良好的离散簇。*比例尺，*10微米。

**图2。**
**膜系泛素的化学计量结合。** *A–C，*100牛顿米Alexa488-标记为他的₆-标记泛素(A类)和20 n米参见647-ESCRT-II标签(B类)一起加载到流动池中。观察到与泛素共定位的ESCRT-II簇的形成，并根据荧光强度估计化学计量比。*D-F中，*泛素I44D不与ESCRT-II共定位。*比例尺，*10微米。

**图3。**
**VPS20与ESCRT-II簇的化学计量组装。** *A–C，*VPS20和ESCRT-II均在5n时加载米浓度进入流动池，并观察到共定位(*上部面板*).D-F中，突变型VPS20^ΔESCRT-II由于ESCRT-II在溶液中的结合而受损，即使在30 n时也没有与ESCRT-III形成簇米.比例尺，10微米。

**图4。**
**ESCRT-II和VPS20随时间在分子尺度上共同组装。** *A中，*10个米Alexa488-标记的ESCRT-II被加载到流动池中。几百帧后，确保流动池达到平衡，20 n米添加罗丹明标记的VPS20。FRET被观察为受体到达时供体荧光的特异性猝灭。单个集群由箭头(A类)，并绘制了该单簇随时间变化的荧光数据(B类).比例尺，10微米。

**图5。**
**ESCRT-II聚集依赖于胆固醇。**将ESCRT-II注射到膜上，在膜上用标准25%胆固醇混合物中的POPC取代胆固醇，以产生指示的胆固醇摩尔分数。我们观察到在低胆固醇浓度下没有聚集(A类和B类; 0或10%），并且在含有15%胆固醇的膜上更弥散地聚集(C类)与膜上含有25%胆固醇的离散簇相比较(D类).E、，二醇酰基PI（3）P支持与25%胆固醇组合的聚类。*比例尺，*10微米。

**图6。**
**脂质相分离与ESCRT聚集相关。** *A中，*20个米未标记的ESCRT-II和40 n米VPS20-Alexa488通过含有0.1%DiD的SLB加载到流动池中(B类). ESCRT-II簇不包括染料。C类，合并A类和*B.比例尺，*10微米。

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