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.2012年6月12日；21(6):751-64.
doi:10.1016/j.ccr.2012.03.048。

LKB1/STK11失活导致黑色素瘤中前转移瘤亚群的扩大

刘文锦 1, 金伯利·B·莫纳罕, 亚当·德·普费勒, 岛村武史, 杰西卡·索伦蒂诺, 基夫·T·陈, David W路障, 大卫·W·奥利拉, 南希·E·托马斯, 迭戈·H·卡斯特里隆, C莱恩·米勒, 查尔斯·佩罗, 王国健, 詹姆斯·E·熊, 诺曼·夏普莱斯
附属公司

LKB1/STK11失活导致黑色素瘤中前转移瘤亚群的扩大

刘文锦等。 癌细胞. .

摘要

LKB1（STK11）的种系突变与Peutz-Jeghers综合征（PJS）相关，PJS包括异常的粘膜皮肤色素沉着，10%的皮肤黑色素瘤中发生体细胞LKB1突变。通过用K-Ras激活（±p53丢失）使小鼠黑素细胞中的Lkb1失活，我们观察到100%外显率的可变色素和高度转移性黑色素瘤。LKB1缺乏导致SRC家族激酶（SFK）YES磷酸化增加，WNT靶基因表达增加，CD24（+）细胞群扩大，这表明相对于同基因CD24（-）细胞，体内外转移行为增加。这些结果表明，在RAS激活的背景下，LKB1失活通过诱导前转移因子CD24（+）肿瘤亚群的SFK依赖性扩张而促进转移。

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数字

图1
图1。Lkb1抑制K-Ras激活诱导的黑素细胞增殖
（A） 图示了所示基因型小鼠原代黑素细胞培养物的生长曲线。在分离后20天，用或不用4-OHT处理细胞以激活CRE重组酶，并在连续传代过程中计算细胞数量。每组至少生成了三条初级线，并显示了具有代表性的结果。误差条显示SD。（B）显示了具有代表性的8周龄成年小鼠的色素沉着变化，这些小鼠具有指定的黑色素细胞特异性基因型。没有K-Ras激活的小鼠表现出正常的色素沉着，而K-Ras表达的队列显示爪子和尾巴上有色素斑，伴随着Lkb1和/或p53丢失，色素沉着增加。（C） 与Lkb1完整小鼠相比，黑素细胞特异性缺失Lkb1和K-Ras活化的代表性小鼠表现出增加和不均匀的毛色色素沉着。另请参见图S1。
图2
图2。Lkb1失活促进黑色素瘤形成和转移
（A） Kaplan-Meier分析显示基因型队列的无黑色素瘤生存率。（B和C）具有代表性的原发肿瘤和转移瘤表现出不同的色素沉着TKLkb1型升/升（B） 和TKp53型升/升; 磅1升/升（C） 展示的是老鼠。法律公告，淋巴结。箭头（B）表示色素沉着的肺转移。另请参见表S1和图S2。
图3
图3。Lkb1缺失促进黑色素瘤细胞体外迁移和侵袭
（A） 对指定基因型的细胞进行体外伤口愈合或划痕试验。代表性显微照片TKLkb1号机组升/升单元格和TKp53基因升/升; 第16页升/升如左图所示。平均闭合指数，如补充实验程序中所述，由右侧的基因型绘制而成（n=3个重复每个基因型）。（B） 对所示基因型的细胞进行Matrigel侵袭试验。左侧显示侵入Matrigel细胞的代表性显微照片，右侧显示所示基因型细胞的平均值（每个基因型3次重复）。（C） 西方分析TKp53型升/升; 磅1升/升用非功能性Lkb1-KD（“激酶死亡”）或Lkb1转导的细胞，以及TKp53型升/升; 第16页升/升介绍了用非特异性shRNA（NS）或靶向Lkb1的shRNA（shLkb1）转导的细胞。U、 未经处理。（D和E）含有和不含Lkb1的等基因细胞分别进行体外划痕试验（D）和Matrigel侵袭试验（E），如（A）和（B）所示。误差条显示SD。*p<0.05**p<0.01。另请参见电影S1和S2以及图S3。
图4
图4。Lkb1丢失导致SFK激活
（A） 具有代表性的西方分析TKp53型升/升; 第16页升/升显示了具有或不具有Lkb1敲除的细胞。细胞裂解物要么用抗p-SFK抗体（Y416）直接免疫印迹（IB），要么先用指示的抗Src、Fyn或Yes抗体免疫沉淀（IP）。NS，非特异性shRNA。（B）TKp53型升/升; 第16页升/升在含有载体（DMSO）或达沙替尼（30nM）的培养基中培养有或没有LKB1敲除的黑色素瘤细胞。在受伤后12小时测量闭合指数。（C）TKp53型升/升; 第16页升/升对LKB1敲除或未敲除的黑色素瘤细胞进行Matrigel侵袭试验，分别用pan-SFK抑制剂达沙替尼（30 nM）处理和不处理。（D） 显示了通过LICOR分析对LKB1定量的指示人类黑色素瘤细胞进行的代表性西方分析。（E） 介绍了通过LICOR分析进行磷酸化YES水平定量的指示人类黑色素瘤细胞中的YES磷酸化。用与（D）中相同的编号标记细胞。（F） 对人黑色素瘤细胞中LKB1和磷酸化YES的表达进行了相关分析。用与（D）中相同的编号标记细胞。用DMSO或30 nM达沙替尼处理（G和H）SKMel23、SKMel63和A2058细胞，并进行体外划痕试验（G）或Matrigel侵袭试验（H）。误差条显示SD。*p<0.05**p＜0.01***p<0.001。另请参见图S4。
图5
图5。YES激酶介导LKB1缺失对黑色素瘤细胞的影响
（A） 说明了有或无LKB1敲除的A2058细胞中SFK成员的酪氨酸磷酸化状态。绘制每个激酶三个重复的平均值。MFI，荧光强度中值。（B）表达shLKB1的A2058细胞转染以SRC、FYN或YES为靶点的干扰对照siRNA或siRNA。转染48小时后，用所示抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。U、 未经处理。（C和D）A2058细胞在LKB1敲除或不敲除的情况下转染了指示的SFK siRNAs。细胞在siRNA转染48小时后进行体外划痕试验（C）或Matrigel侵袭试验（D）。（E和F）荧光素酶表达TKp53型升/升; 磅1升/升通过尾静脉将Yes敲除或不敲除的黑色素瘤细胞注射到裸鼠体内。通过荧光素酶成像（E）和解剖（F）检查小鼠。荧光定量（E）。误差条显示SD。**p<0.01***p<0.001。另请参见图S5。
图6
图6。Lkb1丢失扩展Prometastic CD24+细胞群
（A） 流式细胞术检测指定基因型黑色素瘤细胞CD24的表达。（B）TKp53型升/升; 磅1升/升用Lkb1-KD或Lkb1转导细胞。TKp53型升/升; 第16页升/升用NS或shLkb1转导细胞。通过流式细胞术检测具有和不具有Lkb1功能的细胞的CD24表达。（C和D）CD24+细胞和CD24负极细胞分离自TKp53型升/升; Lkb1型升/升FACS的单元格。分选后的细胞进行划痕试验（C）和Matrigel侵袭试验（D）。（E） CD24型+和CD24负极细胞分离自TKp53型升/升; 磅1升/升和TKp53型升/升; 第16页升/升细胞。如图所示，细胞裂解物在免疫沉淀后进行直接免疫印迹或免疫印迹。误差条显示SD。**p<0.01***p<0.001。另请参见图S6和表S2和S3。
图7
图7。CD24的扩展+LKB1失活反应分数需要YES激酶
（A） CD24的百分比+说明了流式细胞术测定的指示人类黑色素瘤细胞中的细胞。（B） 本文对人黑色素瘤细胞LKB1和CD24的表达进行了相关性分析。LKB1表达在图4D中定量。用与（A）和图4D中相同的编号标记细胞。（C） A2058人黑色素瘤细胞中CD24的表达随着LKB1敲低（shLKB1）而增加。U、 未经处理。用指定浓度的达沙替尼处理LKB1敲除的NS、非特异性shRNA.（D和E）A2058细胞，并在指定时间采集分析。的表达式CD24型用定量RT-PCR检测mRNA（D），并计算其与A2058细胞NS-shRNA的相对表达。用流式细胞术检测CD24蛋白（E）的表达（n=3个重复）。（F） 用指示的SFK siRNA转染LKB1敲除的A2058细胞。转染72小时后（n=3个重复），用流式细胞仪检测CD24的表达。误差条显示SD。*p<0.05**p<0.01***p<0.001。另请参见图S7。
图8
图8。CD24型+细胞表现出比CD24更高的转移潜能–体内细胞
（A–F）CD24+和CD24负极从荧光素酶表达Lkb1缺陷的细胞中分离出(TKp53型升/升; 磅1升/升A–C）和Lkb1-合格(TKp53型升/升; 第16页升/升，D–F）黑色素瘤细胞，并通过尾静脉注射到裸鼠体内（每组6只小鼠）。尾静脉注射三周后，对小鼠进行荧光素酶成像（A和D）和解剖（B和E）检查。荧光定量，并进行统计分析。误差条显示SD。**p<0.01***p<0.001。在尾静脉注射（亲代）前或肺转移生长（转移）后3周，用流式细胞术检测肿瘤细胞CD24表达（C和F）。CD24中未发现转移样本负极的分数TKp53型升/升; 第16页升/升细胞。另请参见图S8。
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参考文献

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