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.2012年8月3日；11(8):4052-64.
doi:10.1021/p3000927。 Epub 2012年6月28日。

肝星状细胞系LX-2细胞外基质的蛋白质组分析确定CYR61和Wnt-5a是纤维化肝的新成分

S塔米尔·拉希德 1, 乔纳森·德·汉弗莱斯, 亚当·拜伦, 阿梅特·达尔, 珍妮特·阿斯卡里, 朱利安·塞利, 大卫·奈特, 罗伯特·D·戈尔丁, 马克·瑟斯, 马丁·J·汉弗莱斯
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肝星状细胞系LX-2细胞外基质的蛋白质组分析确定CYR61和Wnt-5a是纤维化肝的新成分

塔米尔·拉希德等。 蛋白组学研究杂志. .
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摘要

肝星状细胞（HSC）的激活和随后改变的细胞外基质（ECM）的不受控制的积累是肝纤维化的基础，肝纤维化是慢性损伤的伤口愈合反应，可导致器官衰竭和死亡。我们试图对纤维化肝ECM的成分进行分类，以深入了解疾病病因并帮助识别新的生物标记物。从肝纤维化体外模型HSC细胞系LX-2中分离出细胞衍生ECM，并将其与来自人类包皮成纤维细胞（HFFs）的ECM进行比较。细胞衍生ECM的质谱分析确定了61个结构ECM或分泌蛋白（LX-2和HFF分别为48和31个蛋白），置信度≥99%。基因本体富集分析证实了ECM蛋白的富集，层次聚类结合蛋白质相互作用网络分析揭示了富含纤维化ECM的蛋白质子集，突显了细胞类型特异性ECM生态位的存在。与HFF ECM相比，36个蛋白富集到LX-2 ECM，其中Wnt-5a和CYR61在人和小鼠纤维化肝组织中通过免疫组织化学验证。未来的研究将确定这些和其他成分是否在肝纤维化的病因学中发挥作用，是否作为新的疾病生物标记物，或开辟新的药物发现途径。

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数字

图1
图1
CDM的分离和表征。客户尽职调查由5、7、11或14天后的LX-2细胞。（A，B）蛋白质溶解，SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝（A）染色或纤维粘连蛋白或纤维蛋白（B）的蛋白印迹。米克尔表示分子质量标准的位置。（C） 来自的CDM对LX-2细胞和HFF进行免疫荧光处理，染色抗纤维连接蛋白（绿色）和抗纤维蛋白抗体（红色），共聚焦显微镜采集图像。
图2
图2
蛋白质组分析LX-2和HFF CDM。（A，B）维恩图显示通过对LX-2的GeLC-MS分析鉴定的蛋白质数量-和HFF衍生ECM。总共鉴定了277种蛋白质（A）其中61个被定义为ECM或使用UniProt知识库隐藏(网址：http://www.uniprot.org/)（B）。数字表示蛋白质以≥99%的置信度和≥2个独特肽进行鉴定。（C） GO富集分析，突出显著富集的术语与附着力和ECM有关。Bonferroni-修正P（P）-值，并且用于分析的背景数据集为整个人类基因组。
图3
图3
分层的GeLC-MS鉴定的蛋白质聚类分析LX-2和HFF CDM。（A） 无监督的完整输出已鉴定蛋白质的层次聚类分析。定量热图显示平均光谱计数占总光谱计数的百分比每次分析中确定的光谱数量。相关树状图显示基于无中心Pearson的层次聚类使用完整链接进行关联。选定节点的相关性显示。（B–D）ECM和分泌蛋白显示为富含HFF（蓝色竖线；B）、富含LX-2的基因名称（红色竖条；C），HFF和LX-2共享（灰色竖条；D） 集群。星号（B–D）表示ECM和分泌蛋白LX-2的丰度差异具有统计学意义5%FDR时的HFF CDM（Bayes因子≥10，自然长转换折叠变化≥1.5）。
图4
图4
蛋白质-蛋白质LX-2和HFF CDM。（A，B）ECM和LX-2衍生的分泌蛋白（A） 和HFF衍生的（B）ECM被映射到人类相互作用组上生成交互网络模型。蛋白质识别（节点标记有基因名称）显示为一个等级排序的圆圈（蛋白质按绑定伙伴数量的降序逆时针排序连接最紧密的蛋白质位于顶部）。节点的颜色根据将其分层聚类分配给LX-2富集型（红色），富集HFF（蓝色）或LX-2和HFF共享（灰色）簇（垂直图3中的彩色条）。未合并的蛋白质最大的互联网络如下所示网络。
图5
图5
表达式人纤维化肝中的纤维蛋白-2、Wnt-5a和CYR61部分。（A–F）组织切片的代表性图像人丙型肝炎病毒诱导的免疫组织化学染色肝纤维化。纤维蛋白-2染色（A和B）在纤维化组织中观察到地区。Wnt-5a（C和D）和CYR61（E和F）染色定位人肝组织中的纤维化间隔。显示的部分来自不同的个体患者。对照（G）表示切片染色省略了一级抗体。图像是使用10×（A、C、E）和20×（B、D、F、G）目标。
图6
图6
Wnt-5a和CYR61在小鼠肝纤维化中的表达部分。（A–D）组织切片的代表性图像小鼠CCl的免疫组织化学染色4-诱导肝纤维化。Wnt-5a（A和B）和CYR61（C和D）均严重染色小鼠肝组织中的纤维周围区域。控制（E）指示一级抗体缺失的切片染色。图像使用20×（A和C）和40×（B，D、 和E）目标。附加阴性对照组织，其中一级抗体被省略，正常小鼠肝组织被省略补充图S4中提供了Wnt-5a或CYR61未阳性染色。
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