Tumor suppression in the absence of p53-mediated cell-cycle arrest, apoptosis, and senescence

doi:10.1016/j.cell.2012.04.026

.2012年6月8日；149(6):1269-83.

doi:10.1016/j.cell.2012.04.026。

p53介导的细胞周期阻滞、凋亡和衰老缺失时的肿瘤抑制

李同元¹, 宁康, 乐江, 民家滩, 托马斯·路德威格, 赵英明, 理查德·贝尔, 魏谷

附属机构

PMID： 22682249
预防性维修识别码：项目经理3688046
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2012.04.026

p53介导的细胞周期阻滞、凋亡和衰老缺失时的肿瘤抑制

李同元等。单元格. 2012.

.2012年6月8日；149(6):1269-83.

doi:10.1016/j.cell.2012.04.026。

作者

李同元¹, 宁康, 乐江, 民家滩, 托马斯·路德威格, 赵英明, 理查德·贝尔, 魏谷

附属

¹美国纽约州纽约市哥伦比亚大学外科医生学院癌症遗传学研究所，邮编：10032。

PMID： 22682249
预防性维修识别码：项目经理3688046
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2012.04.026

摘要

细胞周期阻滞、凋亡和衰老被广泛认为是p53抑制肿瘤形成的主要机制。然而，尚不清楚它们是否是抑制肿瘤的速率限制步骤。在这里，我们培育出了一个（p53（K117R））或三个（p35（3KR））具有赖氨酸到精氨酸突变的小鼠；K117R+K161R+K162R）的p53乙酰化位点。虽然p53（K117R/K117R）细胞能够胜任p53介导的细胞周期阻滞和衰老，但不能胜任凋亡，但这三个过程在p53（3KR/3KR）细胞中都被消融了。令人惊讶的是，与p53缺失小鼠不同的是，p53（K117R/K117R）或p53（3KR/3KR）动物均未发生早期肿瘤形成，而p53缺失鼠会迅速死于自发性胸腺淋巴瘤。值得注意的是，p53（3KR）保留了调节能量代谢和活性氧产生的能力。这些发现强调了乙酰化在差异调节p53反应中的关键作用，并表明p53的非常规活性，如代谢调节和抗氧化功能，对于抑制早期自发肿瘤发生至关重要。

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数字

**图1。第53页^K117R型正常但完全抑制p21激活前体靶基因**
（A） p53胸腺的Western blot分析^+/+，p53^K117R/K117R和p53^−/−老鼠。四小时后，小鼠要么未经治疗，要么暴露于12.5Gyγ射线照射；分离胸腺细胞并分析其p53、p53、p21、Puma、裂解caspase 3和β-actin的表达。（B） p53胸腺的代表性免疫组织化学染色^+/+和p53^K117R/K117R小鼠裂解胱天蛋白酶3。8周大的小鼠要么未经治疗，要么暴露于5Gy的γ射线照射。四小时后，将这些小鼠的胸腺固定过夜，然后根据标准方案进行处理、石蜡包埋、切片并用抗鼠裂解半胱天冬酶3抗体染色。（C）体内p53的凋亡分析^+/+和p53^K117R/K117R小鼠接受5 Gyγ射线照射。按照（B）所述处理小鼠，然后制备小鼠胸腺细胞的单细胞悬浮液，并用Annexin V-FITC染色以进行FACS分析。（D）细胞凋亡的量化体内以Annexin-V阳性胸腺细胞为代表。误差条表示每个基因型至少三只小鼠的平均值±SD。（E）典型的裂解caspase 3免疫组化染色图像显示p53的脾脏、睾丸和小肠中的凋亡细胞^+/+和p53^K117R/K117R老鼠。8周龄小鼠要么未经治疗，要么暴露于12.5Gy的γ射线照射。然后在4小时后收集组织，并按照（B）所述进行处理。另请参见图S1、图S2和图S3。

**图2。第53页^K117R/K117RMEF保留完整细胞周期检查点和细胞衰老功能对DNA损伤的响应**
（A） p53中Mdm2、p53、磷酸化p53、Puma和p21的Western blot分析^+/+和p53^K117R/K117RMEF未经治疗或用1.0μM Dox（阿霉素）治疗8小时，使用β-actin作为负荷对照。（B） p53中Mdm2、p21、Puma、Killer/DR5和Noxa mRNA的qRT-PCR分析^+/+和p53^K117R/K117RMEF未经处理或用1.0μM Dox处理8小时。数据显示了首先归一化为β-肌动蛋白的特定mRNA的相对数量，然后是来自三个不同MEF系的独立实验的未处理野生型样本值。结果报告为平均值±标准误差（SEM）。（C） p53的细胞生长阻滞分析^+/+和p53^K117R/K117RMEF要么未经处理，要么暴露在5 Gyγ射线照射下。照射23小时后，用10μM BrdU脉冲MEFs 45分钟，然后固定细胞并处理细胞以进行BrdU的免疫荧光分析（绿色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。（D） p53基因BrdU标记的定量^+/+和p53^K117R/K117R用5和10 Gy辐照MEF。误差条代表三个独立实验的±SD。（E） p53蛋白的Western blot分析^+/+和p53^K117R/K117R根据3T3协议培养不同传代的MEF，以检测p53、Arf和p21的表达。（F） p53的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色^+/+和p53^K117R/K117R根据3T3协议培养MEF。按照扩展实验程序所述，固定指定传代的MEF，并对其进行β-半乳糖苷酶活性染色。另请参见图S4。

**图3。小鼠p53在K117、K161和K162处乙酰化位点的缺失会抑制p21和PUMA的激活**
（A）具有三个突变乙酰化位点的小鼠p53蛋白示意图显示，小鼠p53的K117、K161和K162侧翼区域与其他物种的侧翼区域对齐。保守的赖氨酸以红色突出显示，人类p53的Q165以蓝色突出显示，进化上令人想起乙酰化K。（B）含有K161和K162的胰蛋白酶小鼠p53肽的质谱分析。碎片谱¹⁵⁶调幅_公牛AIYK公司_交流电K（K）¹⁶²和¹⁶²K（K）_交流电SQHM（平方毫米）_公牛TEVVR公司¹⁷¹揭示了在K161和K162分别存在乙酰化肽。蛋白质按照实验程序制备。插图显示了高分辨率前体离子质量。标签“Δ”表示水和/或氨损失的“b”或“y”离子。“”K“_交流电“和”M_公牛分别指定乙酰赖氨酸和氧化蛋氨酸。氧化蛋氨酸中的亚硫酸中性损失表示为“-64”。（C） Western blot分析用表达小鼠野生型p53、p53-K117R和p53-3KR突变体的质粒转染的H1299细胞中的p53、Mdm2、Puma和p21。β-actin作为负荷对照。（D）用于p53或p53-3KR突变与p21、Puma和Mdm2启动子中一致位点结合的ChIP分析。用1%甲醛处理转染表达质粒DNA的小鼠p53野生型（WT）和p53-3KR突变体的H1299细胞10分钟，并进行ChIP分析。PCR-琼脂糖凝胶电泳检测p21、Puma和Mdm2启动子中p53或p53-3KR的占有率。IgG抗体作为阴性对照。

**图4。第53页^3公里突变严重抑制p53介导的细胞周期阻滞和凋亡细胞死亡**
（A） p53体内凋亡分析^+/+和p53^{3公里/3公里}老鼠。小鼠要么未经治疗，要么暴露于5 Gyγ射线照射下，然后分离胸腺细胞并用Annexin V-FITC染色以进行FACS分析。（B） Annexin-V阳性细胞代表凋亡的胸腺细胞，在（E）中量化。数据显示为每个基因型至少三只小鼠的平均±SD。（C） p53中Mdm2、p53、磷酸化p53、Puma和p21的Western blot分析^+/+和p53^{3公里/3公里}和p53^−/−MEF未经处理或用0.2μg/ml Dox处理2、4和8小时。β-actin起到了负荷控制的作用。（D） p53细胞周期阻滞分析^+/+和p53^{3公里/3公里}MEFs要么未经处理，要么暴露于5或10 Gy的γ辐射。照射23小时后，用10μM BrdU对MEF进行脉冲处理45分钟，然后固定细胞并进行BrdU免疫荧光分析。在5或10 Gyγ射线照射后，BrdU掺入期间，代表细胞周期S期细胞的BrdU阳性细胞被定量。所示值为三个独立重复的平均值±SD。（E） p53胸腺裂解物中p53、phopho-p53、Puma、p21、裂解caspase 3和β-actin蛋白的免疫印迹分析^+/+，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−小鼠接受12.5Gyγ射线照射4小时后。（F） p53胸腺细胞凋亡的Western blot分析^+/+，p53^K117R/K117R，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−对小鼠进行DNA损伤治疗。小鼠要么未经治疗，要么暴露于12.5Gy的γ射线照射；在照射后的不同时间点分离胸腺细胞，并分析裂解的胱天蛋白酶3的水平。β-actin作为负荷对照。另请参见图S5和图S6。

**图5。第53页^3公里失去诱导p53细胞衰老的能力^{3公里/3公里}MEF公司**
p53中指示mRNA的（A和B）qRT-PCR分析^+/+，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−MEF未经处理或用0.2μg/ml Dox处理8小时。结果显示，特异性mRNA的相对量首先归一化为β-actin，然后归一化到三个不同MEF系的独立实验中未经处理的野生型样本值。误差条代表±SEM。（C）p53的细胞生长率分析^+/+，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−MEF公司。3 × 10⁴在第0天将不同基因型的MEF接种到6孔板中，并每天进行计数。（D） p53的SA-β-半乳糖染色图像^+/+和p53^{3公里/3公里}根据3T3方案培养不同传代的MEF。固定指定传代的MEF并对其进行β-半乳糖苷酶活性染色。p53中p53、Arf和p21的（E和F）免疫印迹分析^{3公里/3公里}（E）和p53^−/−（F）根据3T3方案培养指定传代的MEF。β-actin起到了负荷控制的作用。另请参见图S7。

**图6。第53页^3公里保留其肿瘤抑制活性和激活代谢靶点的能力**
（A） p53的Kaplan-Meier生存曲线^+/+，p53^K117R/K117R，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−老鼠。（B） p53中指示mRNA的qRT-PCR分析^+/+，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−MEF未经处理或用0.2μg/ml Dox处理8小时。数据是每个mRNA数量的平均值±SEM，首先归一化为β-肌动蛋白，然后是三个独立MEF系的未处理野生型样本值。（C） p53全细胞裂解液中p53、Gls2和Tigar蛋白的免疫印迹分析^+/+，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−MEF未经处理或用0.2μg/ml Dox处理8小时。β-actin起到了负荷控制的作用。（D） p53在K117、K161和K162的乙酰化分析^K117R/K117R和p53^{3公里/3公里}MEF细胞。第53页^+/+和p53^{3公里/3公里}和p53^K117R/K117RMEF未经处理或用0.2μg/ml Dox、1.0μM TSA和5 mM烟酰胺处理6小时。用抗AcK120-p53、抗AcK164-p53、抗AcK CT-p53抗体或对照IgG免疫沉淀细胞裂解物，并使用Bethyl Laboratories的ReliaBLOT系统用抗p53（CM5）抗体进行印迹。（E）在转染质粒DNA表达小鼠p53野生型（WT）或p53-3KR突变株的H1299细胞中，用ChIP法检测p53或p53-3 KR突变与p53代谢靶点Gls2和Tigar的一致位点的结合。（F） p53中谷氨酸表达的RT-PCR（上面板）和qRT-PCR分析^+/+，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−通道2的主MEF。数据表示为三个独立实验的平均值±SEM。另见图S7

**图7。第53页^3公里抑制葡萄糖摄取、糖酵解、活性氧水平和菌落形成**
（A） p53的葡萄糖摄取测量^+/+，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−MEF细胞通过摄取2-[^三H] -脱氧葡萄糖。结果显示为三个不同实验的平均值±SD。（B） p53的糖酵解率分析^+/+，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−通过监测5的转化率确定MEF细胞-[^三H] 葡萄糖到^三H（H）₂O如实验程序所述。数值代表三个不同实验的平均值±SD。（C） p53活性氧（ROS）水平的测量^+/+，p53^{3公里/3公里}和p53^−/−MEF细胞使用小鼠ROS ELISA试剂盒进行检测，如实验程序所述。数据报告为三个不同实验的平均值±SD。（D）使用抗FLAG抗体对转染FLAG标记表达质粒的H1299细胞中p53-3KR、Mdm2和Gls2蛋白进行Western blot分析。β-actin作为负荷对照。（E）转染p53-3KR、Mdm2和Gls2的H1299细胞的集落形成试验。用空载体或FLAG-p53-3KR、FLAG-Mdm2或FLAG-Gls2表达质粒转染H1299细胞48小时，然后分裂并进行结晶紫染色显示的集落形成分析。（F）在G418存在下培养12天后，定量转染空载体、FLAG-p53-3KR、FLAG-Mdm2和FLAG-Gls2表达质粒的H1299细胞中形成的菌落。图以空载体转染细胞的菌落百分比表示，值以三个不同实验的平均百分比±SD表示。

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中的注释

p53对肿瘤的抑制：三种病毒的减少？
霍克AK，沃斯登KH。 Hock AK等人。单元格。2012年6月8日；149(6):1183-5. doi:10.1016/j.cell.2012.05.024。单元格。2012 PMID：22682240

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[8] Brady CA、Jiang D、Mello SS、Johnson TM、Jarvis LA、Kozak MM、Kenzelmann Broz D、Basak S、Park EJ、McLaughlin ME等。独特的p53转录程序决定了急性DNA损伤反应和肿瘤抑制。单元格。2011年；145:571–583。-项目管理咨询公司-公共医学

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