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.2012年9月；342(3):709-19.
doi:10.1124/jpet.112.195586。 Epub 2012年6月1日。

线粒体靶向辅酶Q类似物对内皮细胞的生物能量效应

布莱恩·芬克 1, 朱迪思·阿赫林（Judith A Herlein）, 马克·A·约雷克, 阿曼达·M·芬纳, 罗伯特·科恩斯, 威廉·西维茨
附属公司

线粒体靶向辅酶Q类似物对内皮细胞的生物能量效应

布莱恩·芬克等。 药理学实验与治疗杂志. 2012年9月.

摘要

辅酶Q（CoQ）的线粒体靶向类似物正在开发中，以减少各种疾病状态引起的氧化损伤。然而，需要了解这些药物的生物能量效应，以及这些效应是否与氧化还原特性有关，包括其已知的促氧化作用。我们检测了两种喹啉形式的线粒体靶向CoQ类似物，即米托喹啉（MitoQ）和质体喹啉基-癸基-三苯基鏻（SkQ1）在牛主动脉内皮细胞中的生物能量效应。我们使用细胞外氧和质子通量分析仪在完整细胞水平评估线粒体的作用。这两种药物均以剂量依赖的方式降低了针对ATP转换（OCR（ATP））的耗氧量（OCR）（MitoQ的IC值为189±13 nM，SKQ1的IC值是181±7；差异不显著），同时不影响或轻度增加基础耗氧量。这两种化合物在基础状态下增加了细胞外酸化，与糖酵解增强一致。这两种化合物均通过使用线粒体靶向二氢乙硫酸氢钠增强线粒体超氧化物的生成，并且都增加了在分离细胞器之前处理过的细胞线粒体中的H⁄O⁄2的生成。锰超氧化物歧化酶模拟物锰（III）四（1-甲基-4-吡啶基）卟啉并没有改变或实际上增强靶向CoQ类似物降低OCR（ATP）的作用。相反，N-乙酰半胱氨酸减轻了MitoQ和SkQ1的这种影响。总之，我们的数据证明了靶向辅酶Q类似物的重要生物能量效应。此外，这些作用至少部分是通过产生超氧物介导的，但取决于转化为H⁄O⁄。这些生物能量和氧化还原作用需要考虑，因为这些化合物是为了治疗目的而开发的。

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数字

图1。
图1。
SkQ1[10-（6′-塑性喹啉基）癸基三苯基鏻]（顶部）和MitoQ[10-。
图2。
图2。
纳米摩尔浓度（缩写后的数字）的载体（Veh）、MitoQ（MQ）和SkQ1（SK）对不同呼吸条件下测得的耗氧量的影响，如下所述材料和方法在呼吸测定前18小时加入MitoQ或SkQ1。A、 代表性呼吸计实验表明，SkQ1对连续注射所示化合物前后测得的OCR的剂量依赖性影响；寡霉素（2μM）、FCCP（2μM）或抗霉素A（Ant A；0.5μM）加鱼藤酮（Rot；2μM）。MitoQ也有类似的效果（为清晰起见，未显示）。每个数据点表示基底、寡霉素、FCCP和非线粒体OCR期间两到三次测定的平均值（单个孔）。随后面板中的数据表示此实验和此实验的五次重复(n个=每个数据点6；每个数据点表示每个条件下在两到三个井中获得的平均值）。B至F、基础OCR（B）、OCR列车自动防护系统（C） OCR归因于质子泄漏（D），FCCP后的OCR（E），以及所示浓度中受SkQ1或MitoQ影响的非线粒体OCR（F）。条形图上方的数字表示IC50OCR的±S.E.M列车自动防护系统FCCP或EC后的OCR50因为质子泄漏。数据代表平均值±S.E.M.*，第页< 0.05; **,第页通过重复测量和Dunnett事后测试的单向方差分析，与车辆相比，<0.01。注释年-轴刻度差异。集成电路50和EC50SkQ1和MitoQ之间的值没有显著差异。
图3。
图3。
在细胞外流量分析仪运行前30分钟或18小时添加MitoQ和SkQ1的效果。A、 在所示时间段内，暴露于载体（Veh）、200 nM MitoQ（MQ）或200 nM SkQ1（SK）的细胞的生物能量分布。每个数据点代表六口单井测定值的平均值±S.E.M。B至D，定量分析A中的数据，证明200 nM MitoQ或200 nM SkQ1对基础OCR（B）、OCR的影响列车自动防护系统（C） FCCP非耦合呼吸期间的OCR（D）。E到G，300 nM MitoQ或300 nM SkQ1对基础OCR（E）、OCR的定量影响列车自动防护系统（F） FCCP非耦合呼吸期间的OCR（G）。每个数据点代表四到六口单井测定值的平均值±S.E.M.。*，第页<0.05或**，第页与车辆相比<0.01†，第页通过单向方差分析和Tukey事后测试，与30分钟时的相应化合物相比，<0.01。
图4。
图4。
经MTQAs（300 nM）或载体处理的BAE细胞（放大倍数：400×）中检测到的超氧化物释放为MitoSOX荧光。A到E，用MitoQ（A）、SkQ1（B）、载体（Veh）（C）、MitoQ加上超氧化物歧化酶模拟物MnTMPyP（D）或SkQ1+MnTMP（E）处理的细胞。F、 定量结果。每个数据点表示四个实验中每10个代表性细胞单位面积的平均光密度，比较暴露在每个指示条件下的细胞。MQ、MitoQ；SK、SkQ1；相邻数，纳摩尔浓度；M、 MnTMPyP公司。数据表示归一化为车辆处理细胞平均密度的平均值±S.E.M.。*，第页< 0.05; **,第页通过单因素方差分析和Dunnett事后测试，与车辆相比<0.01。
图5。
图5。
H（H）2O（运行）2如图所示，经18小时处理后从BAE细胞中分离出的线粒体（0.1 mg/ml）的产量（MQ，MitoQ；SK，SkQ1）。H（H）2O（运行）2生产量是相对于车辆处理细胞的平均值表示的（参见结果). A、 用5 mM琥珀酸盐+5 mM谷氨酸盐+1 mM苹果酸盐呼吸线粒体，在状态4条件下（不添加ADP）测定其产生率(n个=每种条件下10–12次测定）。B、 生产速率如A所示，但在模拟状态3下，通过添加20μM ADP创建。添加己糖激酶（5 U/ml）和2-脱氧葡萄糖（5 mM）以将ATP（由氧化磷酸化形成）再循环回ADP，从而在整个培养期内保持ADP的可用性(n个=每种条件下的10–12次测定）。*，第页通过单因素方差分析和Dunnett事后测试，与车辆相比<0.01。
图6。
图6。
SOD模拟物MnTMPyP（25μM；−，不存在；+，存在）对用载体（VEH）、200 nM MitoQ（MQ 200）或200 nM SkQ1（SK 200）处理18 h的BAE细胞OCR的影响。MnTMPyP是在添加MTQA或车辆时添加的。基本OCR（A），OCR列车自动防护系统（B） 如图2所示，评估了质子泄漏引起的OCR（C）、FCCP后的OCR，以及呼吸测定期间的非线粒体OCR（E）。每个条形代表平均值±S.E.M(n个=每个数据点6口井）。*，第页< 0.05; **,第页与不存在MnTMPyP的相应条件相比，双尾、非配对t吨测试。
图7。
图7。
10 mM NAC（−，不存在；+，存在）对用载体（VEH）、200 nM MitoQ（MQ 200）或200 nM SkQ1（SK 200）处理18 h的BAE细胞OCR的影响。NAC是在添加MTQA或车辆时添加的。A至D、基础OCR（A）、OCR列车自动防护系统（B） 如图2所示，对呼吸测定过程中质子泄漏引起的OCR（C）和非线粒体OCR（D）进行评估。条形代表平均值±S.E.M(n个=每个数据点8–10口井）。*，第页< 0.05; **,第页与不存在NAC的相应条件相比，双尾、非配对t吨测试。E、 NAC对FCCP呼吸的影响。在没有暴露于MitoQ或SkQ1的情况下，用NAC单独或载体（水，NAC）处理细胞18小时(n个=每个数据点3口井）。数据点（平均值±S.E.M.）表示为添加寡霉素前测定的基线OCR百分比。
图8。
图8。
10 mM NAC（−，不存在；+，存在）对用载体（VEH）、300 nM MitoQ（MQ 300）或300 nM SkQ1（SK 300）处理18小时的BAE细胞中OCR的影响。NAC是在添加MTQA或车辆时添加的。A、 用SkQ1、载体或SkQ1+NAC处理的细胞的生物能量特征。B、 用MitoQ、载体或MitoQ加NAC处理的细胞的生物能量特征。C到E，定量数据显示在OCR下呼吸期间NAC对MTQA处理细胞的影响列车自动防护系统（C） 、质子泄漏（D）和DNP（E）。条形代表平均值±S.E.M(n个=每个数据点4-5口井）。*，第页< 0.05; **第页与不存在NAC的相应条件相比，双尾、非配对t吨测试。
图9。
图9。
MitoQ（MQ）、SkQ1（SK）和丙酮酸盐对呼吸的调节（所有治疗均给予18小时）。浓度（毫摩尔）在命名MQ或SK.A之后表示，MitoQ（200 nM）和SkQ1（200 nM）对OCR的影响，受在没有先前寡霉素的情况下添加的FCCP（2μM）的影响。B、 在向呼吸计（Seahorse Bioscience）培养基中添加丙酮酸（5 mM）的情况下，MitoQ（200 nM）和SkQ1（200 nM）对OCR的影响。A和B中的每个数据点代表六到七口单井测定值的平均值±标准误差。C、 存在SkQ1或MitoQ时丙酮酸对最大非偶联（FCCP）呼吸的定量影响。数据表示为未添加MTQA（仅添加载体）的FCCP呼吸百分比，并表示六到七口井测定值的平均值±S.E.M.。*，第页< 0.05; **,第页< 0.005; ***,第页<0.001，与未配对、双尾的丙酮酸缺乏相比t吨测试。D、 丙酮酸缺乏缓解OCR的作用列车自动防护系统SkQ1或MitoQ在场(n个= 6–7).
图10。
图10。
用MTQAs的阳离子部分MeTPP处理18小时的细胞的生物能量分布。数据表示平均值±标准误差(n个=每个数据点3）。重复此实验，结果相同。Ant A，抗霉素A；腐烂，鱼藤酮。
图11。
图11。
MitoQ或SkQ1处理的BAE细胞的基础OCR与ECAR的比较。A、 细胞以箭头所示的浓度（毫摩尔）暴露于MitoQ 18小时。B、 SkQ1的相应数据。C、 暴露于200 nM MitoQ或200 nM SkQ1 30分钟或18小时的细胞中OCR与ECAR的比率*，第页< 0.01; **,第页通过双向方差分析（时间×MTQA×交互作用），30分钟和18小时之间的差异<0.001。数据代表平均值±S.E.M(n个=每个数据点6）。数据来源于图2和图3以及补充图2。
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