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.2012;7（5）：e37786。
doi:10.1371/journal.pone.0037786。 Epub 2012年5月24日。

甲型流感病毒M1蛋白的解剖：N末端结构域的pH依赖性寡聚和C末端结构域二聚

柯章（Ke Zhang） 1, 赵旺, 刘晓玲, 长城尹, 泽山罗勒, 宾霞（Bin Xia）, 刘文军
附属公司

甲型流感病毒M1蛋白的解剖：N末端结构域的pH依赖性寡聚和C末端结构域二聚

柯章（Ke Zhang）等。 公共科学图书馆综合版. 2012.

摘要

背景：甲型流感病毒的基质1（M1）蛋白在病毒的整个生命周期中发挥着许多关键作用。M1的齐聚对于病毒在组装和出芽过程中基质层的形成至关重要。

方法/主要发现：在本研究中，我们报道了M1可以在体外低聚，并且低聚是pH依赖性的。M1的N末端结构域单独存在于pH 7.4的多阶低聚物中，C末端结构域独自形成一个唯一稳定的二聚体。因此，完整M1可以显示不同形式的低聚物，二聚体是最小的低聚化状态，在中性pH值下。在pH值5.0时，N末端结构域的低聚体完全解离为单体，而C末端结构域保持为二聚体。因此，完整M2的低聚体在酸性pH值下解离为稳定的二聚物。

结论/意义：M1的齐聚反应涉及N端和C端结构域。N末端结构域决定了pH依赖的齐聚特性，C末端结构域形成稳定的二聚体，这有助于M1的二聚。本研究将有助于揭示甲型流感病毒组装和解开过程的机制。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。通过凝胶过滤分析M1的齐聚反应。
在Superdex 200 HR 10/30柱上分析M1的齐聚反应。（A） 从镍亲和层析纯化的M1产生四个峰，其洗脱体积已指示。收集每个峰的样品并用SDS-PAGE进行分析。（B） 收集、浓缩15.8-ml组分（来自面板A），并在pH 7.4的条件下，以不同浓度将其重新应用于凝胶过滤柱上。（C） 不同浓度的M1在pH 5.0的凝胶过滤柱上以单峰形式洗脱。（D） 峰1、峰2、峰3分别对应于在pH 7.4的凝胶过滤柱上重新施加的10.1-ml、11.2-ml和13.5-ml M1馏分。峰4对应于在pH值5.0的凝胶过滤柱上重新应用的11.2-ml分数。
图2
图2。M1的交叉链接分析和GST下拉分析检测到M1分子之间的直接相互作用。
（A） 在没有交联剂的情况下，车道1为M1，车道2为交联M1二聚体。（B） 谷胱甘肽-葡聚糖结合的GST-M1或GST与hisM1在结合缓冲液（pH 7.4）中孵育。在用不同pH（7.4或5.0）的缓冲液广泛洗涤后，提取与珠子结合的hisM1，并用抗His抗体通过免疫印迹进行分析。
图3
图3。凝胶过滤法分析M1N的齐聚反应。
（A） 从镍亲和层析纯化的M1N在Superdex 200上产生五个峰。显示洗脱体积。收集每个峰的样品并用SDS-PAGE进行分析。（B） 收集、浓缩17.6 ml组分（来自面板A），并在pH 7.4的条件下以不同浓度重新应用于色谱柱。（C） 不同浓度的M1N在pH 5.0的凝胶过滤柱上以单峰形式洗脱。（D） 峰1、峰2、峰3分别对应于在pH 7.4的凝胶过滤柱上重新涂抹的9.8-ml、11.3-ml和13.5-ml M1N馏分。峰4对应于在pH值5.0的凝胶过滤柱上重新应用的11.3-ml分数。
图4
图4。沉降速度分析超速离心法测定了N末端结构域的齐聚状态。
（A和C）面板显示了沉降系数分布c（s）在pH 7.4（A）下，从17.6-ml馏分中提取纯化M1N，在pH 5.0（C）下从17.4-ml馏分分离纯化M1N。数据是在蛋白质浓度为1.2 mg/ml时获得的。（B和D）c（s）个面板A和面板C的数据。
图5
图5。GST下拉检测到N末端结构域之间的直接相互作用。
谷胱甘肽-葡聚糖结合的GST-M1或GST与M1N在结合缓冲液（pH 7.4）中孵育。在用不同pH值（7.4或5.0）的缓冲液充分洗涤后，提取与珠子结合的M1N，并用抗-His抗体进行免疫印迹分析。
图6
图6。C末端结构域齐聚的表征。
（A） 亲和层析后，不含N末端GST标记（亲和性）的纯化M1C在Superdex 200柱上产生单峰（1）。样品也通过Tricine-SDS-PAGE进行分析。（B） 收集并浓缩面板A中17.3 ml的C末端结构域部分，并重新应用于凝胶过滤柱。显示了不同负载浓度和不同pH值下M1C的洗脱位置。（C） 面板显示了沉降系数分布c（s）个纯化M1C，pH 7.4时浓度为2.8 mg/ml。（D） M1C的分子质量分布来源于c（s）个面板C的数据。（E）M1C的交叉链接。车道1是不含交联剂的M1C，车道2是交联的M1C二聚体。车道3和车道4分别为M1N，未经交联剂处理/未经交联处理。中心车道是分子质量标记。（F） 在pH 7.4下进行下拉试验。在结合缓冲液（pH 7.4）中，将凝胶过滤纯化的M1C与GST-珠结合的GST-M1结合。与GST-M1结合的hisM1作为阳性对照。M1C或hisM1与GST孵育后作为阴性对照。用抗M1单抗检测结合的M1C。
图7
图7。用CD和荧光光谱分析了M1C的结构特征。
（A） pH 7.4下M1C的二级结构研究。显示了M1C在5µM（点划线）、30µM（点划线）、60µM（点划线）和100µM（实线）浓度下的CD光谱。（B） 在pH 7.4的222 nm下记录了M1C在60µM蛋白质浓度下的热变性。（C） 显示了M1C在室温（实线）、37℃培养10分钟（虚线）和60℃培养10 min（点线）下的Far-UV CD分析。（D） pH 7.4时ANS与M1C结合的荧光光谱。显示了ANS（点线）、25°C下M1C存在下的ANS（虚线）和37°C下与M1C结合的ANS的荧光光谱（实线）。
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