Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome

doi:10.1016/j.cell.2012.04.027

.2012年6月8日；149(6):1368-80.

doi:10.1016/j.cell.2012.04.027。 Epub 2012年5月17日。

哺乳动物基因组中5-羟甲基胞嘧啶的碱基分辨率分析

苗玉¹, 加里·霍恩, 基思·舒尔瓦赫（Keith E Szulwach）, 春晓松, 梁张, 奥黛丽·金, 李雪坤, 清岱, 尹慎, Beomseok公园, 郑和云（音）, 彭进, 冰人, 川河

附属公司

PMID： 22608086
预防性维修识别码：下午3589129
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2012.04.027

哺乳动物基因组中5-羟甲基胞嘧啶的碱基分辨率分析

苗玉等。单元格. 2012.

.2012年6月8日；149(6):1368-80.

doi:10.1016/j.cell.2012.04.027。 Epub 2012年5月17日。

作者

苗玉¹, 加里·霍恩, 基思·舒尔瓦赫（Keith E Szulwach）, 春晓松, 梁张, 奥黛丽·金, 李学坤, 青黛, 尹慎, Beomseok公园, 郑和云（音）, 彭进, 冰人, 川河

附属

¹美国伊利诺伊州芝加哥大学生物物理动力学研究所化学系，邮编60637。

PMID： 22608086
预防性维修识别码：项目经理3589129
内政部： 2016年10月10日/j.cell.2012.04.027

摘要

5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的研究由于缺乏一种在全基因组范围内以单碱基分辨率进行定位的方法而受到阻碍。基于亲和纯化的方法无法准确定位5hmC，也无法准确确定其在每个修饰位点的相对丰度。我们在此提出了一种全基因组方法，即Tet-assisted subistrite sequencing（TAB-Seq），当与传统的亚硫酸氢盐测序相结合时，可用于以基本分辨率绘制5hmC，并量化5hmC和5mC的相对丰度。将该方法应用于胚胎干细胞不仅证实了5hmC在哺乳动物基因组中的广泛分布，而且揭示了5hmC位点的序列偏差和链不对称性。我们在转录因子结合位点附近观察到高水平的5hmC和低水平的5mC。此外，不同功能序列元素之间5hmC的相对丰度差异显著，表明5hmC沉积和维持的机制不同。

PubMed免责声明

数字

**图1。TAB-Seq策略和验证**
**（A）**TAB-Seq的示意图。基因组DNA中的5个hmCs受到糖基化保护，然后通过Tet介导的氧化将5个hmC转化为5caCs。亚硫酸氢盐处理后，5caC（由5mC生成）和C均显示为T，而5gmC（由原始5hmC生成）显示为C。如图1A所示，对带有5mC（左）或5hmC（右）修饰的76米dsDNA进行TAB-Seq。Sanger测序结果显示，5mC完全转换为T（左），5hmC仍读作C（右）。（C）用模型DNA对TAB-Seq产物进行质谱表征。dsDNA在退火为11 mer互补链的9 mer链上包含5 mC（左）或5 hmC（右）。DNA受到βGT介导的葡萄糖基化和mTet1介导氧化。通过MALDI-TOF/TOF监测反应，并显示计算和观察到的分子量。（D）用蛋白质印迹法验证基因组DNA（小鼠ES）中5mC和5hmC的转化。用抗5mC、5hmC、5fC和5caC抗体分别对未处理DNA、βGT处理DNA和βGT/mTet1处理DNA进行斑点杂交检测。糖基化后未见5hmC。在mTet1介导的氧化后，几乎所有的5mCs都转化为5caCs。另请参见图S1。

**图2。5hmC全基因组碱基分辨率图谱的生成**
（A）在POU5F1基因附近的H1细胞中，与基于亲和力的5hmC图谱（灰色）相比，基础分辨率5hmC图谱（红色）的快照。还显示了H1细胞（黑色）中传统亚硫酸氢盐测序的碱基分辨率图。正值（深色）表示Watson链上的胞嘧啶，而负值表示Crick链上的胞嘧啶。对于5hmC，垂直轴限制为−50%至+50%。对于传统的亚硫酸氢盐测序，极限为-100%至+100%。仅显示测序到深度≥5的胞嘧啶。（B）与随机选择的5mC（白色）相比，5hmC与82221个先前通过亲和图谱（黑色）确定为富含5hmC的基因组区域重叠（参见扩展实验程序）。（C）与参考人类基因组相比，5hmC位点的序列上下文。（D）修饰胞嘧啶的5hmC和5mC估计丰度的热图显著富含5hmC。根据传统亚硫酸氢盐测序（5hmC+5mC）减去测量的5hmC速率，估算出5mC。（E） 5hmC场地5hmC（红色）和5mC（绿色）估算丰度的分布。m：中位数。另请参见图S2。

**图3。5hmC位点的基因组分布**
（A） H1 5hmC与基因组元件的重叠。基因特征是从UCSC已知基因数据库中提取的（Hsu等人，2006）。启动子-远端调控元件（TSS中>5kb）反映了ChIP-Seq和DNase-Seq实验中H1细胞中实验定位的调控元件。每个5hmC碱基计数一次：基因组元素的重叠排除了所有先前重叠的胞嘧啶，如箭头所示。绿色：启动子近端；红色：启动子-远端调控元件；灰色：基因区；白色：基因间区域。（B） H1 5hmC（黑色）和随机位点（灰色）在基因组元素处的相对富集，标准化为元素类型的总覆盖率。随机包括10个5mC的随机取样（见扩展实验程序）。（C）几类基因组元素的5hmCG（左）和5mCG（右）水平在H1中显著富集了5hmCG（p=0.01，二项式）。虚线表示5mC非转换率。颜色如（A）所示。（D） H1中远侧调节元件的百分比显著增加5hmCG。（E）在小鼠ES细胞中，几类基因组元件的5hmCG绝对水平显著增加了5hmCGs（p=0.01，Fisher精确检验）。颜色如（A）所示。（F）对于在H1 ES细胞中显著富集5hmCG并在小鼠中保存的基因组元件，5hmCGs在小鼠ES细胞中的分布。颜色如（A）所示。在所有面板中，增强子、p300、CTCF和DNase I位点的定义均为启动子远端（TSS>5-kb）。另请参见图S3。

**图4。远端调节元件处5hmC的剖面图**
（A）远端p300结合位点周围5hmC的频率。（B）包含OCT4/SOX2/TCF4/NANOG基序的远端p300结合位点周围5hmCG（红色）和5mCG+5hmCG的绝对水平（蓝色条，中心；共识：ATTTGCATACAATG）。5mC（绿色）估计为传统亚硫酸氢盐测序（5hmC+5mC）的速率减去测量的5hmC速率。上半部分表示包含该基序的链上富集，下半部分表示相反的链。（C）相对于CTCF基序（蓝色条，底部），远端CTCF结合位点周围5hmC的频率。不同的线代表不同的链，与CTCF基序有关（共识：ATAGTCCACCTGGGCCA）。Opp，对面。（D）锚定在CTCF基序（蓝色条，中心）的远端CTCF结合位点周围5hmCG、5mCG和5mCG+5hmCG的绝对水平。颜色如（B）所示。另请参见图S4。

**图5。5hmCG左右不对称**
（A）命名法示意图。5hmC（红色）的胞嘧啶被指定为“call”，而相反链（绿色）上的胞嘧啶则指定为“observative”。（B）称为5hmCG残基（红色）的平均5hmC丰度与相反的胞嘧啶残基（绿色）相比。称为：称为胞嘧啶；opp：与胞嘧啶相反。（C）对于具有5hmC（左）或5mC+5hmC（右）的被叫胞嘧啶，被叫和对侧胞嘧啶的平均5hmC和5mC（白）丰度。5mC（白色，不包括黑色）估计为传统亚硫酸氢盐测序（5hmC+5mC）的速率减去测量的5hmC速率。灰线：5mC非转换率。（D）与传统亚硫酸氢盐测序（绿色，5mCG+5hmCG）中观察到的差异相比，被称胞嘧啶和对胞嘧啶之间5hmCG（红色）的差异分布。被称为和相对的胞嘧啶各自被测序到至少深度10。（E）对于5hmC-called位点，5hmCG丰度在called和相反的胞嘧啶对处的热图（左）。对于传统亚硫酸氢盐测序中的5mC-called位点，在called对和相反的胞嘧啶对（右）处有5mCG+5hmCG丰度的热图。另请参见图S5。

**图6。5hmCG附近的局部序列上下文**
（A）与随机选择的相同数量的mCG位点（右）相比，5hmCG位点周围的序列上下文±150bp（左）。所示序列与5hmC在同一条链上。插图：Watson或Crick链上5hmCG位点周围的序列上下文±10bp。正坐标表示3'方向。（B）对于在Watson链和Crick链之间显示出5hmCG显著差异的胞嘧啶（p=0.01，Fisher精确检验），以及显示出显著链偏倚的位点周围鸟嘌呤±50bp的丰度（p=0.01，Fisher精确检验），显示的是这两个事件共同发生的频率。另请参见图S6。

**图7。5hmCG偏向低CpG区域**
所示为5hmCG百分比的热图（TSS或DHS±250bp），作为a）H1 ES细胞中启动子的CpG密度的函数，B）小鼠ES细胞中的启动子，D）缺乏H3K4me1和H3K27ac的DHS位点，E）具有稳定增强子染色质特征的DHS站点，以及F）具有活性增强子染色体特征的DHS站点。（C）富含5hmC的启动子与未富集5hmC启动子的GC含量相对于CpG含量。另请参见图S7。

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中的注释

第六个基数和计数。
拉斯克北。拉斯克北。自然方法。2012年7月；9(7):646. doi:10.1038/nmeth.2095。自然方法。2012 PMID：22930833 没有可用的摘要。

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