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.2012年6月22日；149(7):1635-46.
doi:10.1016/j.cell.2012.05.003。 Epub 2012年5月17日。

mRNA甲基化的综合分析显示3’UTR和近终止密码子富集

凯特·D·梅耶 1, 优格仕Saletore, 保罗·津博, Olivier Elemento公司, 克里斯托弗·梅森, 萨米·贾弗里
附属公司

mRNA甲基化的综合分析显示3’UTR和近终止密码子富集

凯特·D·梅耶等。 单元格. .

摘要

腺苷（m（6）A）N（6）位置的甲基化是RNA的转录后修饰，其发病率和生理相关性尚不清楚。最近发现，肥胖风险基因FTO编码一种m（6）A脱甲基酶，这意味着m（6”A是生理过程的重要调节器。在这里，我们提出了一种转录组宽m（6）a定位方法，该方法结合了m（6A）a特异性甲基化RNA免疫沉淀和下一代测序（MeRIP-Seq）。我们使用这种方法鉴定了7676个含有m（6）A的哺乳动物基因的mRNA，表明m（6。我们发现m（6）A位点在终止密码子附近和3'UTR中富集，并且我们揭示了m6 A残基与3'UTRs中的microRNA-binding位点之间的关联。这些发现为鉴定作为腺苷甲基化底物的转录物提供了资源，并揭示了哺乳动物转录组的表观遗传调控。

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数字

图1
图1。m的特异性和敏感性6A特异性抗体
答：。斑点杂交分析显示m的抗体特异性6A.含有m或m的寡核苷酸数量增加6将腺苷或未经修饰的腺苷标记在膜上，并用探针进行探测6抗体。同时增加m6当m的浓度增加时，可以观察到免疫反应6A寡核苷酸（顶部），在A寡核苷酸的最高浓度下仅观察到免疫反应的背景水平（底部）。所示斑点代表了三个实验的结果。B。在100 ng m的膜上进行竞争斑点杂交分析6含A的寡核苷酸。抗体与m结合6随着m的增加，寡核苷酸通过预培养减弱6包含A的竞争RNA（顶部），但不包含包含未修饰腺苷的RNA（底部）。竞争对手RNA的使用量（从左到右）：0 ng（0 nM）、10 ng（0.1 nM），100 ng（1.1 nM）和1µg（11.2 nM）。所示斑点代表了四个实验的结果。C、。竞争斑点杂交分析按（B） ●●●●。抗体预孵育时N个6-甲基三磷酸腺苷(N个6-MeATP）、三磷酸腺苷（ATP）、，N个1-三磷酸甲基腺苷(N个1-MeATP），或2'-O（运行）-甲基腺苷三磷酸（2'-O（运行）-MeATP）。仅限N个6-MeATP能够与抗体结合竞争。所用竞争核苷酸的浓度（从左到右）：0µM、1µM、2µM、4µM。所示斑点代表了三个实验的结果。D。m的检测6细胞内DNA。基因组DNA分离自大坝+（包含m6A） 或大坝−（缺少m6A）大肠杆菌剪切并用抗m抗体进行免疫印迹6抗体。虽然DNA是dam−大肠杆菌加载后（左侧面板），抗体只识别m6DNA中的一种存在大坝+大肠杆菌（右侧面板）。所示斑点代表了三个实验的结果。另请参见图S2。
图2
图2。m的分布和动态细胞调节6RNA中的A
答：。m的广泛分布6各种组织中的水平。从小鼠脑、心、肺、肝和肾（顶部）分离的总RNA经m6免疫印迹分析。28S rRNA的溴化乙锭染色显示为负载控制（底部）。B。m的量化6各种组织中的丰度。m的量化6免疫反应性（A）通过密度测定法测量并归一化为每个组织相应的28S rRNA带的强度(n个= 3; 数据表示为平均值±SEM）。C、。米6A在mRNA中富集。使用寡核苷酸（dT）Dynabeads从小鼠大脑总RNA中分离聚（A）RNA，并将未结合的“流通”RNA保存为聚（A）缺失部分。等量的总RNA、聚（A）RNA和聚（A6免疫印迹分析（顶部）。28S rRNA的溴化乙锭染色显示为负载控制（底部）。密集型m6在poly（A）RNA部分观察到免疫反应，与高水平的m6mRNA中的A。D。mRNA中poly（A）尾部的耗尽不会降低m6A in-mRNA。使用寡核苷酸（dT）Dynabeads从小鼠大脑总RNA中分离出Poly（A）RNA。然后，通过与寡核苷酸（dT）引物杂交并用RNase H进行消化，将一半样品进行聚（A）尾缺失6抗体（顶部面板）显示m水平6A in poly（A）RNA（左）和poly（A）tail-depleted RNA（右）具有可比性。用3'RACE和RTPCR检测β-肌动蛋白，确认去除了聚（A）尾巴；当寡核苷酸（dT）引物用于cDNA合成时，在尾部缺失样品中未检测到任何产物（中间面板）。作为对照，使用随机六聚体成功地在两个样品中生成产品（底部面板）。另请参见图S1。
图3
图3。m的调节6细胞和发育过程中的A水平
答：。m的个体发育6丰富的大脑发育。在胚胎第18天（E18）、出生后第0天（P0）、出生后第14天（P14）和成年时从小鼠大脑中分离出总RNA，然后进行免疫印迹分析以检测mRNA6包含A的成绩单。溴化乙锭染色28S rRNA条带显示为负载控制。B。FTO使多种细胞转录物去甲基化。FTO在HEK293T细胞中表达48h，细胞RNA经免疫印迹分析检测mRNA6A.另见图S1。
图4
图4。MeRIP-Seq协议概述和顺序读取分配
答：。MeRIP-Seq的示意图。总RNA经过RiboMinus处理以去除rRNA物种。含有m的RNA6然后通过将RNA与m混合进行免疫沉淀6一种抗体偶联的Dynabeads。米6然后从抗体偶联珠中洗脱含A的RNA，并进行第二轮m6免疫沉淀。由此产生的RNA库，高度富集了m6然后对含有A的RNA进行下一代测序。B。测序读数及其与m周围基因组位置的比对示意图6一个网站。顶部：包含单个m的mRNA6沿着其长度的残渣。中间：单个100 nt宽mRNA片段，在m6免疫沉淀，每个免疫沉淀都含有相同的m6上述mRNA的残基。底部：直方图显示通过对单个免疫沉淀片段进行测序获得的MeRIP-Seq读数的预测频率。预计读取频率会随着距离m越来越近而增加6一个场地，形成一个“山峰”，其底部约200 nt宽，中点约100 nt宽。C、。MeRIP-Seq的顺序读取收敛到m以上6A站点。来自MeRIP-Seq数据的代表性UCSC基因组浏览器图，显示了m站点周围典型的读取频率峰值形成6A（此处显示的是第6页). 峰值高度显示为每百万映射读取的每基读取数（BPM）。另请参见图S2、S3。
图5
图5。m的验证6A m的目标和特征6A本地化
答：。不同的测序平台和抗体导致相似的m6A配置文件。UCSC Genome Browser轨迹显示三个MeRIP-Seq复制（MeRIP1、MeRIP2和MeRIP3）的读取簇，沿着Ldlr公司成绩单。最上面的轨迹（非IP）代表非免疫沉淀对照样品。B。m的验证6含A的mRNA经MeRIP-Seq鉴定。基于杂交的RNA下拉用于分离Ldlr公司来自大脑总RNA的mRNA，然后确认m6用抗m抗体进行免疫印迹分析发现（箭头）6A.使用相同大小的非特异性探针（对照探针）并行运行对照样品。小鼠大脑总RNA（输入RNA）作为m的参考6标签。C、。m的转录全分布6一座山峰。显示m百分比的饼图6不同RNA序列类型内的峰值（顶部）和非IP样本读数（底部）。米6与非IP样本中的读取分布相比，A在3’UTR和CDS中高度富集。D。m的分布6mRNA转录物长度的峰值。RefSeq mRNAs的5’UTR、CDS和3’UTR分别被分为占其总长度1%的区域，以及m6确定了每个箱子内的峰值。显示了小鼠大脑峰值百分比（红色）和HEK293T峰值百分比（蓝色）的移动平均值。E.公司。高度相似m6在许多人类和小鼠转录本中观察到峰值分布。UCSC Genome Browser绘图显示MeRIP-Seq读取代表性转录本中的簇SREK1号机组.MeRIP-Seq读取位于相同不同区域的群集SREK1号机组在HEK293T细胞RNA（顶部）和小鼠大脑RNA（底部）中。另请参见图S4–S7，表S1-S6。
图6
图6。MeRIP-Seq揭示了m的特性6mRNA中的A
答：。m的系统发育保守性6一座山峰。PhyloP分数为m6将A峰区域与基因外显子中随机洗牌的区域进行比较。保存分数中位数明显较高（K-S检验*第页≤2.2e−16)单位：m6A峰值（0.578）高于随机区域（0.023）。B。m内识别的序列基序6一座山峰。基序G[AG]ACU及其变体（[AC]GAC[GU]、GGAC、[AU][CG]G[AG]AC和UGAC）在m6一座山峰。此外，一个富铀基序（右下）被确定为在m范围内显著缺乏代表性6一座山峰。每个图案下的颜色条表示m区域内代表不足（蓝色）或代表过度（黄色）的程度6非IP控制样本（CNTL）和MeRIP样本（MeRIP）中出现峰值。C、。米6基序序列通常位于m的中心附近6一座山峰。所示为m的累积分布图6m内的图案位置6包含单个图案的山峰。基序聚集在峰的中心，表明这些基序中的甲基化腺苷解释了m6MeRIP-Seq中确定的峰值。D。m的示例6峰中心附近的基序。UCSC基因组浏览器绘图，包含MeRIP-Seq读取（红色）和非IP控制读取（黑色）的轨迹Ilf2型轨迹。m6在Ilf2型3'UTR包含单个m6一个在(B类). 这个图案的序列（以黄色突出显示）位于m的中心6一座山峰。E.公司。m的分布63’UTRs内的A峰和miRNA靶位点。m的频率6图中显示了沿3'UTR长度的峰值（蓝色）和miRNA靶点（红色）。F、。3'UTR甲基化与miRNA丰度之间的关联。大脑中25种最丰富的miRNAs的m6与25种表达最弱的脑miRNAs相比，靶mRNA 3'UTR内的A峰值出现在3’UTR内（*p<0.05，Wilcoxon检验）。A和F中的误差线表示最高和最低值，方框边界表示第一个四分位、中间值和第三个四分位数。另请参见图S3、S6和S7。
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