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.2012;7（5）：e36510。
doi:10.1371/journal.pone.0036510。 Epub 2012年5月3日。

基于代谢状态适应性的转移性乳腺癌细胞筛选

巴尔拉吉·辛格 1, 凯伦·泰, 西蒙·马丹, 米兰R Raythatha, 阿曼达·M·卡迪, 梅根·布劳林, 拉塔夏·R·欧文, 安库尔·巴贾杰, 安东尼·卢奇
附属公司

基于代谢状态适应性的转移性乳腺癌细胞筛选

巴尔拉杰·辛格等。 公共科学图书馆一号. 2012.

摘要

在极不均匀的人群中，一小群适应性强的乳腺癌细胞会导致癌症转移。在这里，我们描述了一种基于功能的策略，用于选择适应性强并导致恶性肿瘤的罕见癌细胞。虽然癌细胞依赖某些营养物质，例如葡萄糖和谷氨酰胺，但我们假设，导致恶性肿瘤的适应性癌细胞必须具有适应性代谢状态，并且可以使用稳健的选择策略来识别这些细胞。不出所料，从侵袭性乳腺癌细胞株SUM149中提取谷氨酰胺后，超过99.99%的细胞死亡。不含谷氨酰胺存活和增殖的罕见细胞具有很强的适应性，这是通过不含葡萄糖或血清的长时间细胞培养进行的额外强健适应性测试来判断的。我们成功地从我们测试的几种侵袭性乳腺癌细胞系中分离出罕见的代谢可塑性谷氨酰胺依赖性（Gln-ind）变体。Gln-ind细胞过度表达环氧合酶-2，这是肿瘤侵袭性的指标，他们能够调节谷氨酰胺酶水平以适应谷氨酰胺的可用性。Gln-ind细胞不依赖于凤尾草，对化疗药物阿霉素和紫杉醇耐药，对高浓度COX-2抑制剂塞来昔布耐药。在事先选择对化疗药物或塞来昔布耐药的细胞后，能够适应谷氨酰胺不可用的细胞数量增加，进一步支持了细胞适应性和治疗耐药之间的联系。Gln-ind细胞显示出氧化应激的迹象，并产生钙粘蛋白11和波形蛋白，这是间充质表型的指标。根据发生率和发生时间判断，Gln-ind细胞在裸鼠体内的致瘤性和转移性高于亲代细胞系。随着我们减少异种移植中癌细胞的数量，注射亲本细胞系的小鼠的肺转移和原发性肿瘤生长受到损害，但注射Gln-ind细胞的小鼠没有受到损害。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：HostGator是一家网络托管商业公司，它捐款支持Anthony Lucci博士对乳腺癌转移的研究。这并不会改变作者对所有PLoS ONE数据和材料共享政策的遵守程度。所有其他作者都声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。谷氨酰胺缺乏对乳腺癌细胞株的影响。
按照材料和方法中的描述，在有或无Gln的情况下培养指示细胞系。显示了完全培养基（+Gln）与无Gln培养基（−Gln）中培养物的照片。结果总结见表1。
图2
图2。从乳腺癌细胞系中选择Gln-ind变体。
（A–C）50万个细胞被放置在一个10厘米的培养皿中。第二天，将培养基换成含有透析的胎牛血清的不含Gln的培养基。拍摄在这些条件下生长2-4周的细胞集落。（D，E）用结晶紫染色的菌落盘。（F） SUM149-Luc-Gln诱导细胞在无Gln-培养基中生长。
图3
图3。Gln-ind细胞中谷氨酰胺酶水平低。
在Gln-ind和亲本SUM149-Luc细胞中，通过western blotting分析可能参与Gln成瘾（GLS，Myc）和转移（COX-2，Myc）的选定蛋白。由于通过western blotting发现Gln-ind细胞中的β-actin水平低于亲本细胞系，因此我们纳入了额外的凝胶负载控制：使用Hsp90和GAPDH抗体进行western blotting，并对凝胶进行考马斯蓝染色。
图4
图4。COX-2敲除不影响Gln-ind细胞中Myc、GLS、HK II和LDH A蛋白水平。
我们用COX-2特异性siRNA或对照siRNA转染生长不含Gln的SUM149-Gln-ind细胞，并通过western blotting与亲本SUM149-Luc细胞系中的细胞相比，分析Myc和参与Myc介导的糖酵解（己糖激酶II和乳酸脱氢酶a）和谷氨酰胺酶（谷氨酰胺酶）的一些蛋白的水平。
图5
图5。在COX-2过度表达、塞来昔布耐药的SUM149-CER细胞系中，COX-2功能与Myc在调节糖酵解和谷氨酰胺分解中相关。
我们用COX-2特异性siRNA或对照siRNA转染SUM149-CER细胞，并通过western blotting分析Myc和参与Myc介导的糖酵解（己糖激酶II和乳酸脱氢酶a）和谷氨酰胺酶（谷氨酰胺酶）的一些蛋白的水平。
图6
图6。模型总结了western blot分析和其他数据。
适应性Gln-ind细胞具有高水平的COX-2和Myc蛋白，但它们能够分离Myc表达和GLS表达。缺乏这种适应性的大多数细胞可能在无Gln培养基的初始选择中已经死亡。如本研究所述，折断的箭头表示Gln-ind细胞中COX-2功能与Myc功能分离的适应性，以及Myc功能与GLS水平分离的适应性。
图7
图7。N-乙酰半胱氨酸治疗后COX-2水平降低。
我们将双亲SUM149-Luc和Gln-ind细胞系（均生长在含谷氨酰胺的培养基中）暴露于N-乙酰半胱氨酸24小时，然后使用等量的细胞裂解物进行蛋白质印迹。由于β-肌动蛋白不是蛋白质负荷的可靠指标，我们平行运行凝胶并用考马斯蓝染色。左侧面板底部的车道编号1-6与右侧面板中的车道编号1-6相对应。
图8
图8。谷氨酰胺依赖型表型具有适应性但稳定。
顶部面板：GLS在含有谷氨酰胺的培养基中生长时的诱导。将生长在无Gln培养基中的SUM149-Gln-inded细胞转移到含有Gln的培养基中，并在培养基改变后的不同时间点用western blotting分析GLS。底部面板：显示了不同条件下生长的细胞形态。（A） Gln-ind细胞在没有Gln的情况下生长。（B） Gln-ind细胞在有Gln的情况下生长（它们在生长时表现出更快的生长和形态改变）。（C） Gln-ind细胞在含有Gln-的培养基中培养8代，然后转入无Gln-培养基培养7天。
图9
图9。在缺乏葡萄糖的情况下，与亲代细胞相比，Gln-ind具有更高的适应性/存活率。
细胞培养物被剥夺葡萄糖28天，然后恢复并生长13天，然后菌落被结晶紫染色。Gln-ind细胞（右）产生了大量的菌落，尽管菌落较小。
图10
图10
（A） 在无血清的情况下，Gln-ind与亲代细胞相比具有更高的适应性/存活率。细胞培养物被剥夺血清25天，所得菌落被结晶紫染色。（B） 与亲代细胞相比，Gln-ind具有更高的锚定独立性。12000个细胞在含有0.35%低熔点琼脂糖的Gln培养基中培养23天，所得菌落用结晶紫染色。
图11
图11。Gln-ind细胞对阿霉素和紫杉醇的耐药性增加。
如材料和方法中所述，用200nM阿霉素（顶部）或5nM紫杉醇（底部）处理亲本SUM149-Luc细胞系或Gln-ind细胞7天，并允许其在无药物培养基中恢复2周（阿霉素处理）或1周（紫杉醇处理），然后对集落进行染色。
图12
图12。Gln-ind细胞对塞来昔布的耐药性。
用50µM塞来昔布处理亲本SUM149-Luc细胞系或Gln-ind细胞的100万个细胞，使罕见的存活细胞生长成集落。然后通过胰蛋白酶将细胞分散，并将其置于含有谷氨酰胺（完全培养基）或不含谷氨酰胺的培养基中。
图13
图13。注射Gln-ind细胞的裸鼠肺转移增加。
在第83天收集注射到脂肪垫的小鼠荧光素酶图像，显示细胞类型和细胞数量。在第90天处死三只小鼠，称重其原发肿瘤，并测定其肺部的荧光素酶活性。数据表明，注射20000或2000 SUM149-Luc细胞的小鼠肺转移受损。相比之下，所有注射了Gln-ind细胞的小鼠，包括那些注射了200个细胞的小鼠都发生了肺转移。
图14
图14。注射亲本SUM149-Luc细胞而非Gln-ind细胞的小鼠在减少注射细胞数量后，原发性肿瘤生长受损。
将细胞（2亿至200万）重复注射到44天龄裸鼠的胸部脂肪垫中（细胞数量从左至右递减）。第62天收集的荧光素酶图像显示，注射亲本细胞系的小鼠的原发肿瘤生长在注射细胞数量减少到2000个以下时显著减少或消失。相反，所有注射了Gln-ind细胞的小鼠都发生了肿瘤，包括两个只注射了200个细胞的小鼠。左边的空插槽对应于因肿瘤负担高而需要处死的小鼠。
图15
图15。Gln-ind细胞中钙粘蛋白11水平增加。
我们通过western blotting检测了亲本SUM149-Luc细胞系和Gln-ind细胞系中钙粘蛋白1的水平，这两个细胞系都生长在含有Gln的培养基中，而Gln-ind-细胞生长时没有Gln，如底部所示。
图16
图16。检测Gln-ind细胞中的波形蛋白。
左侧，我们用COX-2特异性siRNA或阴性对照siRNA转染SUM149-Luc和Gln-ind细胞，让细胞在有或无Gln的情况下生长3天，如底部所示，然后进行western blotting检测波形蛋白。正确的，用SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析亲本SUM149-Luc细胞系和Gln-ind细胞的裂解物。箭头表示Gln-ind细胞中存在一条明显的波形蛋白大小带，而亲本细胞中不存在。左侧车道显示预处理分子量标记。所有样品均在单一凝胶上运行；然而，我们删除了兴趣车道之间存在的一些无关车道。
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