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.2012年1月至4月；3(1):88-100.
doi:10.4161/nucl.18954。

人癌细胞间期的瞬时核膜破裂

杰西·德·巴尔加斯 1, 艾米丽·哈奇, 丹尼尔·安德森, 马丁·海策
附属公司

人癌细胞间期的瞬时核膜破裂

杰西·德·巴尔加斯等。 核. 2012年1月至2月.

摘要

肿瘤细胞通常以核膜（NE）的特殊形态异常为特征，一个多世纪以来，NE一直被用于癌症诊断。NE是一种双磷脂双层，包裹核基因组，调节RNA和蛋白质的所有核转运，防止大分子在核质和细胞质之间的被动扩散。细胞的正常功能和细胞核结构完整性的丧失是否会造成后果尚不清楚。利用活细胞成像技术，我们描述了一种现象，即几个增殖的人类癌细胞系的细胞核在间期暂时断裂。值得注意的是，NE断裂与核质和细胞质蛋白的定位错误有关，在最极端的情况下，还与细胞核内部的细胞质细胞器被包裹有关。此外，我们观察到间期微核样结构的形成以及染色质从核空间中的移动。这些NE断裂事件的频率在核片（为NE提供机械支持的中间丝网络）未正确形成的细胞中较高。我们的数据揭示了NE不稳定性的存在，这种不稳定性有可能改变癌细胞的基因组结构。

关键词：癌症；基因组不稳定性；活生生的想象；核膜；核渗透屏障。

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数字

无
图1。相间核包膜破裂。（A） GFP瞬时转染U2OS细胞三-NLS和每3分钟36小时的图像显示NE的瞬时相间破裂，随后GFP恢复三-NLS进入细胞核。（B） 破裂事件的动力学。每隔30秒对表达GFP-NLS的U2OS细胞成像，以高时间分辨率捕获NERDI。GFP强度通过将每个细胞的最大和最小强度分别设置为1和0进行标准化。绘制了单个相间NE破裂的曲线拟合图（线）以及原始数据（点）。使用以下方程拟合数据：Y=IF（X<X0，Y0，IF（X<X1，Y0-S*X，底部+（顶部-底部）/（1+10^（（对数50-X）*山坡）））其中：X0是高原和溢出事件之间的拐点，Y0是高原值，X1是恢复的初始点，S是溢出斜率，Bottom是恢复的下高原，Top是恢复的上高原，Log50是恢复50%的点，HillSlope是线性恢复率。（C） HeLa宫颈和SJSA骨肉瘤细胞系的代表性图像显示不同类型的癌细胞溢出。（D） GFP瞬时转染U2OS细胞三-NLS和每3分钟一次的图像显示局部核变形和来自变形部位的细胞质GFP信号。
无
图2。层粘连蛋白水平降低会加重核破裂。（A） 与仅报告者（无）、干扰siRNA或未转染的IMR90对照组相比，经针对3个层粘连蛋白基因LBR和Lap2b、Nup93或Nup107的两轮siRNA敲除治疗后U2OS细胞中NERDI的频率（p=0.02 3LamKD vs Scram.siRNA）。细胞被成像36小时，频率代表在实验过程中经历至少一次间期NE破裂的细胞比例。（B） U2OS的透射电子显微镜（TEM）通过shRNA稳定降低层粘连蛋白B1的表达，并用单宁酸染色以增强层粘连可视化（实心箭头）。典型的NE疝气表现为单宁酸染色减少（箭头所示）。（C） 用3个层粘连siRNA处理的U2OS细胞破裂动力学。每30秒对转染GFP-NLS和3个层黏连siRNA池的U2OS细胞进行成像，以高时间分辨率捕获NERDI。如图1B所示，各个相间NE破裂的曲线拟合与原始数据（点）一起绘制（线），并显示事件的动态。（D） 从每条曲线中获得破裂恢复半衰期，并对对照细胞和3个经lamin-siRNA处理的细胞进行平均，测得的半衰期分别为~6和~12 min。（E） 左：shRNA稳定降低U2OS细胞层粘连B1的表达，并表达GFP三-NLS报告者瞬时转染mCherry单独或mCherry-LmnB2标记的人层粘连蛋白B2（mCherry-LmnB2）。对36小时成像的转染细胞进行NERDI频率分析。分析中排除含有mCherry-LmnB2聚集体的细胞。右图：用mCherry或mCherry-LmnB2转染细胞并成像36小时后，测定每个细胞的平均溢出次数。对于这两种细胞，在2个实验中n≥340个细胞。误差条是标准误差，通过学生t检验，细胞核溢出的细胞百分比差异显著（p≤0.01）。
无
图3。核和细胞质成分定位错误。（A） shRNA稳定降低U2OS细胞层粘连蛋白B1的表达，表达GFP三-NLS报告子，用抗eIF4AIII的抗体染色（红色）、微管蛋白（白色）和用Hoechst染色的DNA（蓝色）显示出特征性NE突出（顶部箭头），在间期NE破裂过程中eIF4AIII的细胞质定位（中间面板，箭头），相应的可溶性微管蛋白核流入（中间，实心箭头与开放箭头）与具有特征性浓缩DNA和微管蛋白纺锤体的有丝分裂NEBD形成对比（下图，箭头）。缩放面板显示扩散核微管蛋白可视化的线性亮度增加。（B） 作为A部分处理的U2OS细胞，UPF1（红色）和tubulin（白色）染色。在间期破裂事件中，UPF1存在于核内部（顶面，箭头），与有丝分裂NEBD相比，染色质结构和有丝分裂纺锤体（底部，箭头）。C） U2OS细胞NERDI的时间序列图像显示事件期间NE变形和破裂以及染色质动力学。用GFP监测核完整性三-NLS（绿色）和染色质与H2B-mCherry（红色）报告。GFP公司三-NE破裂时NLS扩散至细胞质；H2B-mCherry溢出到细胞质中，但包含在NE边界外的局部区域。
无
图4。相间核破裂的后果。（A） 表达GFP的U2OS细胞三-NLS（绿色）和pTurboRFP-mito（红色）以及用Hoechst（蓝色）染色的DNA显示共焦切片中的核线粒体（顶部）、最大强度投影（中部）和显示核线粒体的3D重建（箭头）。（B） shRNA使U2OS细胞的TEM稳定降低层粘连蛋白B1的表达，显示胞质小体被包裹在细胞核内（i和ii），与具有特征性NE双膜和核糖体修饰的细胞核内陷形成对比（iii）。（C） 癌症细胞间期核包膜破裂（NERDI）的建议模型。层粘连蛋白表达减少导致NE减弱，向外扩张，最终破裂，核和细胞质成分混合。
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