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.2012年6月12日；109(24):9448-53.
doi:10.1073/pnas.1201840109。 Epub 2012年5月7日。

肝纤维化消退过程中肌成纤维细胞恢复为非活性表型

塔蒂亚娜·基塞莱娃 1, 闵聪, 白永汉, 大卫·肖尔滕, 姜春燕, 克里斯·本纳, 岩崎敬子, 托马斯·穆雷·莫里斯, 布莱恩·斯科特, 冢本秀一（Hidekazu Tsukamoto）, 西尔维亚·M·埃文斯, 沃尔夫冈·迪尔曼, 克里斯托弗·K·格拉斯, 大卫·A·布伦纳
附属公司

肝纤维化消退过程中肌成纤维细胞恢复为非活性表型

塔蒂亚娜·基塞莱娃等。 美国国家科学院程序. .

摘要

肌成纤维细胞在肝纤维化中产生纤维瘢痕。在四氯化碳（CCl（4））肝纤维化模型中，静止的肝星状细胞（HSC）被激活成为肌成纤维细胞。当去除潜在的病原体时，临床和实验性纤维化发生显著消退，这些肌成纤维细胞完全消失。虽然一些肌成纤维细胞凋亡，但在纤维化消退过程中，其他肌成纤维纤维细胞是否会恢复为非活性表型尚不清楚。我们使用基于Cre-LoxP的肌成纤维细胞基因标记来阐明HSC/肌成纤维蛋白在CCl（4）和酒精诱导的肝纤维化恢复过程中的命运。在这里，我们证明，一半的肌成纤维细胞在肝纤维化消退过程中逃避凋亡，下调成纤维基因，并获得与静止的HSC相似但不同的表型，在对成纤维刺激的反应中更快地重新激活为肌成纤维母细胞，并强烈促进肝纤维化。HSC的失活与抗凋亡基因Hspa1a/b的上调有关，这些基因参与HSC在培养和体内的存活。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
肝纤维化的消退伴随着肌成纤维细胞的丢失。(A类)未经治疗的Col-GFP小鼠肝脏的比较4-处理（2个月），或从CCl中回收4（1和4个月）关于GFP表达、天狼星红染色和α-SMA免疫组织化学。使用10倍和20倍物镜显示了典型的亮场和荧光显微照片。(B)中相同四组的量化A类羟脯氨酸含量、天狼星红染色、α-SMA免疫荧光、GFP表达、胶原-α1（I）mRNA水平和α-SMA mRNA水平*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.05. (C类)HSC（维生素A+)构成>90%的肌成纤维细胞（维生素A+GFP公司+)流式细胞术检测CCl非实质细胞组分4-治疗（2个月）Col-GFP小鼠(n个= 3). (天)工作假设：CCl4诱导qHSC活化为aHSC/肌成纤维细胞。基于Cre-loxP的基因标记标记I型胶原表达的aHSC/肌成纤维细胞的命运(SI附录，图S1). 从CCl恢复期间4-肝纤维化，aHSC可能(我)凋亡（无基因标记的YFP+HSC将留在肝脏中）或(ii（ii）)灭活（所有YFP+细胞存活）或(三)一些会凋亡，一些会失活（YFP+iHSC将有<100%的aHSC）。
图2。
图2。
基因标记的aHSC在恢复1个月后仍然存在。(A类)胶原蛋白-α2的肝脏（I）Cre-YFP公司小鼠（无损伤：n个= 4; CCl公司4-处理：n个= 8; 恢复时间：1个月n个=10）用于YFP、GFAP、Desmin或α-SMA。YFP在恢复1个月后鉴定出基因标记的HSC+Desmin表达+或GFAP+细胞。YFP的数量+HSC是相对于总HSC计算的（100%，合并1，P（P）与CCl相比<0.054和恢复组）。显示Nuclei（DAPI，合并2）。(B)HSC（维生素A+)来自胶原蛋白-α2（I）Cre-YFP公司小鼠（无损伤：n个= 4; CCl公司4-处理：n个= 6; 恢复时间：1个月n个=6）用流式细胞仪进行分析。同时使用维生素A鉴定基因标记的aHSC和iHSC+和YFP+表达式。显示了点图；P（P）<0.01（与YFP相比+aHSC和YFP+iHSC）。(C类)基因标记GFP+HSC在他莫昔芬诱导的Col-α2（1）的肝脏中持续存在ER-预处理-GFP从CCl中恢复1个月后4为了避免HSC在发育过程中出现遗传标记，他莫昔芬诱导的Col-α2（1）ER-预处理-GFP小鼠通过交叉Col-α2（1）产生ER核心小鼠×Rosa26flox-Stop-mTRed-flox-mGFP小鼠（此处标记为Rosa26f/f-mTRed（f/f-mTR）小鼠），并用CCl处理4（2个月），在CCl的最后一周每天服用三苯氧胺诱导aHSC的基因脉冲标记4治疗。治疗后，小鼠恢复1个月以逆转肝纤维化。通过膜标记GFP的免疫染色显示基因标记的HSC+（同时失去mTRed表达：合并1），取DAPI染色的细胞核（合并2），20倍物镜。基因标记GFP的数量+HSC以Desmin的百分比计算+HSC（100%，合并3）。针对CCl，实现了35±6%aHSC的遗传标记4.GFP+iHSC（14±4%）在恢复1个月后在肝脏中持续存在(P（P）< 0.05; CCl公司4和恢复组进行比较），确认CCl4-纤维化消退后，活化的HSC（及其后代）仍留在肝脏中。
图3。
图3。
HSC（1个月恢复）获得了与qHSC不同的新表型。(A类)来自Col-α1（1）的HSCCre-YFP公司将未受伤或恢复1个月后的小鼠培养48 h±TGF-β1（2 ng/mL，6 h），用RT-PCR分析成纤维基因和神经基因的表达*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.05. (B)CCl公司4-治疗Col-GFP小鼠（2×CCl4;n个=4）恢复6个月，然后再次接受CCI4受伤。比较这些小鼠与接受CCl治疗的同窝小鼠肝纤维化的发展4仅第二次（1×CCl4;n个=4）天狼星红。通过荧光显微镜对Desmin和α-SMA的aHSC数量进行估算(P（P）<0.05，使用20倍物镜）。羟脯氨酸法测定胶原沉积总量*P（P）< 0.01. (C类)HSC是从胶原-α1（I）-GFP/β-actin-RFP小鼠中分离出来的，未受损伤或从CCl中恢复（7天或1个月）后4损伤，肝内转移（2.2×105单元格）转换为1-d旧Rag2−/−γc−/−幼崽。遵循CCl4受伤，RFP数量+GFP公司+根据HSC总数（由Desmin检测）计算7天和1个月后植入的qHSC和HSC。
图4。
图4。
基因标记的HSC在恢复1个月后获得新的“失活”表型。(A类)微阵列分析。维生素A+HSC从Col-α2（I）中分离纯化Cre-YFP公司未经治疗的小鼠(n个=6），纤维化(n个=6），恢复7天后(n个=3），恢复1个月后(n个= 6). YFP公司+和YFP−然后将HSC置于小鼠全基因组微阵列中。显示了每个HSC组的代表性单元格编号。(B)YFP公司+iHSC（1个月恢复）下调成纤维基因的mRNA，上调PPARγ和Bambi，但不上调其他qHSC基因（Adfp、Adipor1、GFAP）。结果显示使用Agilant微阵列获得的相对mRNA水平（标准化值/多探针/基因的平均值）*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.001. (C类)基因表达谱聚类分析确定不同HSC表型之间的相似性。相关系数用于比较qHSC（1.00）基因表达模式与YFP+iHSC（0.76）和aHSC（0.63）表达模式。(天)确定YFP的特征基因表达+iHSC（1个月）和YFP+HSC（恢复7天，7天）和折叠诱导（与YFP相比+aHSC）。
图5。
图5。
基因标记YFP+恢复后第7天，HSC上调生前Hsp1a/b基因。(A类)YFP生前Hsp1a/b基因的上调+恢复7天时的HSC。结果表示为相对mRNA水平（标准值/多探针/基因的平均值；*对<0.001）通过Agilant微阵列获得。(B)Hspa1a/b诱导细胞凋亡−/−和野生型HSC通过乙醛毒素（25 nM，4 h）和TNF-α（20 ng/mL）+放线菌素（0.2μg/mL）作用18 h(C类)Hspa1a/b型−/−和野生型（Wt）小鼠逐渐受到CCl4伤后恢复2周，用天狼星红（Sirius Red）对肝脏进行分析，并进行Desmin和α-SMA染色（显示阳性区域）。与CCl比较，计算恢复期间纤维化的回归和纤维原性肌成纤维细胞的消失4治疗（100%），并显示为天狼星红-、Desmin-和α-SMA阳性区域的百分比*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.05.
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中的注释

  • 肝纤维化消退的基础是纤维化细胞逆转。
    弗里德曼SL。 弗里德曼SL。 美国国家科学院院刊2012年6月12日；109（24）：9230-1。doi:10.1073/pnas.1206645109。Epub 2012年5月29日。 美国国家科学院院刊，2012年。 PMID：22645354 免费PMC文章。 没有可用的摘要。
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