Proteomic and metabolomic analyses of mitochondrial complex I-deficient mouse model generated by spontaneous B2 short interspersed nuclear element (SINE) insertion into NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe-S protein 4 (Ndufs4) gene

doi:10.1074/jbc.M111.327601

.2012年6月8日；287(24):20652-63.

doi:10.1074/jbc。M111.327601。 Epub 2012年4月25日。

B2短穿插核元素（SINE）自发插入NADH脱氢酶（泛醌）Fe-S蛋白4（Ndufs4）基因产生的线粒体复合物I缺陷小鼠模型的蛋白质组学和代谢组学分析

附属公司

PMID： 22535952
预防性维修识别码： PMC3370248型
内政部： 10.1074/jbc。M111.327601号

B2短穿插核元素（SINE）自发插入NADH脱氢酶（泛醌）Fe-S蛋白4（Ndufs4）基因产生的线粒体复合物I缺陷小鼠模型的蛋白质组学和代谢组学分析

狄龙·W·梁等。生物化学杂志. 2012.

.2012年6月8日；287(24):20652-63.

doi:10.1074/jbc。M111.327601。 Epub 2012年4月25日。

附属

¹澳大利亚维多利亚州帕克维尔市Walter and Eliza Hall医学研究所分子医学部，邮编3052。

PMID： 22535952
预防性维修识别码： PMC3370248型
内政部： 10.1074/jbc。M111.327601号

摘要

真核细胞通过线粒体复合物网络和称为氧化磷酸化系统的电子载体以ATP的形式产生能量。在哺乳动物中，线粒体复合体I（CI）是该系统的最大组成部分，由线粒体和核DNA编码的45个不同亚单位组成。被诊断为NDUFS4基因突变的人类通常患有Leigh综合征，这是一种在婴儿期或儿童早期发病的神经退行性疾病。NDUFS4基因编码细胞核DNA编码的CI亚单位（NADH脱氢酶泛醌Fe-S蛋白4）。NDUFS4患者的线粒体通常缺乏可检测的NDUFS4protein，并显示CI稳定性/组装缺陷。在这里，我们描述了一种由插入Ndufs4的转座元件引起的隐性小鼠表型，该转座元件通过新的连锁和表达分析进行鉴定。该突变被命名为Ndufs4（fky），导致纯合小鼠所有组织中的异常转录剪接和Ndufs4蛋白缺失。Ndufs4（fky/fky）小鼠表现出的身体和行为症状包括暂时的毛发脱落、生长迟缓、步态不稳以及尾巴悬吊时的异常身体姿势。使用蓝色天然PAGE对Ndufs4（fky/fky）小鼠的CI进行分析，结果显示存在迁移速度更快的致残复合体。这个受损的CI缺乏“N组装模块”的亚单位，其中包含NADH结合位点，但包含两个完整CI中不存在的组装因子。通过串联质谱对血液进行的代谢组学分析表明，羟酰基肉碱种类增加，这意味着CI缺陷导致NADH/NAD（+）失衡抑制线粒体脂肪酸β氧化的比率。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**纯合子“funky”突变小鼠出现短暂脱发(A类)以及繁荣的失败(B类).** A类在P17附近，胆小的老鼠脖子后面出现秃顶，沿着躯干（第21页）向尾巴（第24页）推进，之后毛发以相同的顺序生长。B类，生长曲线比较纯合子时髦男性和女性与正常同龄人。从15天大开始，纯合小鼠的生长速度下降。n个=受影响男性为6(*M（M）*,影响);n个=33（对照雄性）(*M（M）*,控制);n个=10（受影响女性）(F类,影响);n个=20（对照组雌性）(F类,控制);第页= 10⁻⁵男性；第页= 10⁻⁵针对女性。*误差线*、瑞典。

**图2。**
**“funky”突变是B2 SINE插入*恩杜夫斯4*.** A类，测序色谱仪比较*恩杜夫斯4*野生型和纯合型小鼠外显子3；插入序列在外显子5′端开始后52nt开始。B类，RepeatMasker输出显示插入序列与B2_Mm1a的对齐；176个nt中的171个=97%匹配。过渡和置换表示为我和*v（v）*分别是。C类,*恩杜夫斯4^弗基*显示B2插入和靶位点重复的位点(*TSD公司*)序列。

**图3。**
**B2正弦插入*恩杜夫斯4*结果所有受试组织中出现孤立CI缺乏。** A类，RT-PCR显示截断*恩杜夫斯4*全脑RNA转录本*恩杜夫斯4^飞/飞*老鼠；野生型转录变体(*第1版*)通过克隆测序进行鉴定；这个*示意图*上*正确的*描述凝胶上可见的不同扩增子；*白色箭头*指出终止密码子的位置。B类，NDUFS4蛋白在大鼠的全脑、心脏、肝脏和骨骼肌中未检测到*恩杜夫斯4^飞/飞*小鼠通过蛋白质印迹。C类，CI活性，根据柠檬酸合成酶标准化(*反恐精英*)，在所有测试的组织中减少*恩杜夫斯4^飞/飞*老鼠(n个= 3–5).D类线粒体CII、CIII和CIV活性在*恩杜夫斯4^飞/飞*老鼠(n个= 4).E类，心脏和大脑线粒体的ATP合成能力被确定为CI依赖性ATP生成（与底物结合苹果酸和谷氨酸）与CII依赖性ATP的生成（与在CI抑制剂鱼藤酮存在下的底物琥珀酸）标准化并显示为控制线粒体的百分比（年龄范围P30–P41，心脏n个=13，大脑n个= 5).C类和D类,黑条、野生型小鼠；*白色条*,*恩杜夫斯4^飞/飞*老鼠。E类,控制,*恩杜夫斯4*^+/*^（f）*⁺和*恩杜夫4*^+/*^弗基*;*飞/飞*,*恩杜夫斯4^飞/飞*. *,第页< 0.05; **,第页< 0.01; ***,第页< 0.005; #,第页< 0.001; ##,第页< 0.0005; ###,第页< 0.0001; ####,第页< 0.00005.误差线、瑞典。

**图4。**
**NDUFS4的耗尽会改变CI的装配状态。** A类，代表性BN-聚丙烯酰胺凝胶，当*恩杜夫斯4^飞/飞*心脏线粒体溶解于1%n个-十二烷基β-麦芽糖苷(*驾驶员侧车门模块*;*车道2*). 什么时候？*恩杜夫斯4^{fky（fky）/fky（fky）}*心脏线粒体在1%Triton X-100中溶解(*TX100型*)、CI-CIII₂超复合体(*联合国安全理事会*)可以观察到(*车道3*和4). 大部分CI-CIII₂在以下情况下检测到SC处于跛行状态*恩杜夫斯4^飞/飞*线粒体(*车道4*).B类，BN-PAGE和抗CI亚单位NDUFA9抗体的Western blot显示CI的弱染色和损伤状态(*CI公司*)单体和CI-CIII₂(*CI/CIII公司₂*)来自*恩杜夫斯4^飞/飞*老鼠。

**图5。**
**线粒体中受损CI的纳米LC-MS/MS分析结果示意图*恩杜夫斯4^飞/飞*老鼠。** 左侧，野生型小鼠CI中存在不同的模块。赖特，我来自残废的综合体*恩杜夫斯4^飞/飞*小鼠遗漏了构成N模块的所有亚单位，而组装因子Ndufaf1和Ndufaf2与受损复合物I相关。纳米LC-MS/MS分析结果的表示基于McKenzie和Ryan描述的组装模型（64）。

**图6。**
**NDUFS4缺失导致串联MS测量的血液代谢物水平发生显著变化。** *A–C*，对干血斑卡血液的串联质谱分析显示，羟酰肉碱种类显著增加，其质量相当于羟基-C4:0酰肉碱、羟基-C16:0酰肉碱和羟基-C18:1酰肉碱*恩杜夫斯4^飞/飞*老鼠。*D–F型*，唯一显著变化的氨基酸水平是甘氨酸、苯丙氨酸和高瓜氨酸（均增加）。n个=27（对于控制装置）；n个=26恩杜夫4^飞/飞.误差线、瑞典。

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