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.2012年5月；122(5):1764-76.
doi:10.1172/JCI59581。 Epub 2012年4月16日。

边缘肌营养不良2H小鼠模型中的卫星细胞衰老是肌病的基础

埃琳娜·库德里亚舍娃 1, 伊琳娜·克拉默洛娃, 梅丽莎·J·斯宾塞
附属公司

边缘肌营养不良2H小鼠模型中的卫星细胞衰老是肌病的基础

埃琳娜·库德里亚舍娃等人。 临床研究杂志. 2012年5月.

摘要

E3泛素连接酶三分基序包含32（TRIM32）的突变是导致边缘肌营养不良2H（LGMD2H）的原因。此前，我们培育出了Trim32基因敲除小鼠（Trim32-/-小鼠），并显示出伴随神经原性特征的肌病表型。在这里，我们使用这些小鼠来研究由于缺乏TRIM32而引起的肌肉特异性缺陷，这是肌病表型的基础。使用两种诱导性萎缩模型，我们表明TRIM32对肌肉萎缩是可有可无的。相反，TRIM32是萎缩后肌肉再生所必需的。此外，由于PIAS4、E3 SUMO连接酶和TRIM32底物的积累，TRIM32缺陷的原代成肌细胞发生过早衰老和肌生成受损，而这些底物先前被证明与衰老有关。在萎缩/再生模型中，在体内也观察到成肌细胞过早衰老。与野生型肌肉相比，Trim32-/-肌肉的活化卫星细胞显著减少，PIAS4水平增加，生长障碍。此外，Trim32-/-肌肉表现出早期肌肉减少的特征，如选择性II型快速纤维萎缩。这些结果表明，肌肉卫星细胞的过早衰老是LGMD2H的潜在致病特征，并揭示了我们认为与可用卫星细胞减少和过早肌肉减少相关的肌营养不良的新机制。

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数字

图1
图1。禁食导致的萎缩通常发生在修剪32–/–老鼠。
(A类)具有统计学意义(P（P）<0.05）两种基因型的小鼠因禁食24小时或48小时而体重减轻。年体重减轻率修剪32–/–禁食小鼠与修剪32+/+费率(n个= 4). 误差条代表sem(B类)剥夺食物48小时后，腓肠肌重量减少了20%，与之类似修剪32–/–和修剪32+/+老鼠。(C)高分子量泛素蛋白结合物的积累在修剪32–/–和修剪32+/+肌原纤维，如抗泛素（Ub）蛋白印迹染色所示。显示了一个具有代表性的斑点。Ponceau S染色显示为负载控制。(D类)在从修剪32+/+和修剪32–/–通过考马斯染色SDS-PAGE的密度测定法，喂养小鼠和禁食48小时的小鼠。未观察到修剪32–/–和修剪32+/+样品。
图2
图2。修剪32–/–后肢悬吊后，在重新加载过程中，肌肉无法再生。
横截面积的测量(A类)快速和(B类)慢速光纤修剪32–/–和修剪32+/+比目鱼肌在冰冻切片上进行抗快速和抗慢速肌球蛋白抗体免疫染色。每种基因型四组小鼠(n个=6）分析如下：动态对照小鼠（对照）；小鼠给予5天的悬浮液（susp）；小鼠先给予5天的悬浮液，然后再进行3天（3d rel）或7天（7d rel）的重新加载。数值表示6张幻灯片中每张幻灯片在几个独立视场中的测量平均值（每张幻灯片测量的纤维数>100）。误差条代表SEM(*P（P）< 0.05). (C)使用从修剪32+/+控制、暂停和重新加载肌肉(n个=3）表示升高修剪32暂停和重新加载阶段的表达。每组3个样品的结果一式三份，标准化为Gapdh公司，表示为相对于动态控制的百分比(*P（P）< 0.05). 数据显示为平均值±SEM(D类)抗TRIM32蛋白印迹显示TRIM32在三分之一32–/–肌肉和TRIM32蛋白水平的增加修剪32+/+暂停和重新加载阶段的肌肉。抗病毒印迹显示为加载控制。TRIM32斑点下每条车道上的数字代表TRIM32相对于动态控制标准化为vinculin的折叠变化。显示了具有代表性的斑点。
图3
图3。AKT信号在修剪32–/–肌肉。
(A类)用总AKT、活化AKT磷酸特异性（P-Ser473-AKT）、总核糖体蛋白S6和磷酸-S6抗体对非卧床对照小鼠、悬浮5天（悬浮）的小鼠或悬浮后再装载3天（重新装载）的小鼠比目鱼肌提取物的代表性Western blot进行染色。抗病毒蛋白和抗结蛋白印迹显示为加载控制。密度测定数据(B类)磷酸-AKT和(C)磷酸化S6印迹分别归一化为总AKT或总S6。后肢悬吊5天后，在不活动状态下，磷酸-AKT和磷酸-S6水平均下降(*P（P）<0.05），并在重新加载时恢复(*P（P）< 0.05, **P（P）<0.03）类似修剪32–/–和修剪32+/+肌肉。数据(n个=4）表示为平均值±SEM。
图4
图4。细胞凋亡在修剪32–/–骨骼肌。
进行TUNEL标记，并在整个比目鱼肌横截面上量化TUNEL阳性凋亡细胞核（绿色）。为了可视化肌肉纤维和细胞核，用抗肌营养不良蛋白（红色）和DAPI（蓝色）对切片进行复染。显示了染色的典型示例。比例尺：25μm。每组分析四到六个样本修剪32–/–和修剪32+/+基因型：动态对照；将小鼠置于5天的悬浮液中；小鼠先进行5天的悬浮试验，然后再进行3天的重新加载（rel）。与同一基因型的动态对照组相比，两种基因型在后肢悬吊5天后不活动期间TUNEL阳性核数增加(**P（P）<0.02），与相同基因型的悬浮小鼠的观察值相比，在重新加载期间有所下降(*P（P）< 0.05). 在测试的任何时间点，两种基因型之间均无统计学差异。数据显示为平均值±SEM。
图5
图5。修剪32–/–原代成肌细胞在体外分化受损。
(A类和B类)从修剪32+/+和修剪32–/–肌肉用肌源细胞标记物结蛋白进行免疫染色，以显示肌源细胞培养物的纯度和丰度。用Hoechst染料对细胞进行复染以观察细胞核。比例尺：10μm。(A类)生长培养基中的原代成肌细胞（GM）。(B类)在切换到分化培养基（DM）48小时后，两种培养物中的成肌细胞融合和肌管形成明显。(C)核分布指数（每个肌管的核数）在10个独立的视野中进行量化。数据显示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05). (D类)每个培养物测量30个肌管的直径。数据显示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05). (E类)蛋白质印迹分析修剪32+/+和修剪32–/–在生长培养基中进行原代成肌细胞培养，并在切换到分化培养基后8、24或60小时进行培养。TRIM32在中无法检测到修剪32–/–细胞。包括文丘里蛋白和GAPDH印迹，以显示细胞裂解物中蛋白质的相对浓度。MyoD1，肌源性承诺的早期标志物；n/m MyHCIIa，非肌肉肌球蛋白重链IIa；n/mMyHCIIb，非肌肉肌球蛋白重链IIb；肌生成素，肌源性分化的标志物；MyHC-dev，肌特异性肌球蛋白重链发育；MyHC快速，肌肉特异性肌球蛋白重链快速。
图6
图6。原代成肌细胞的细胞周期分析。
原代成肌细胞用PI染色并用流式细胞术进行分析，如方法所述。(A类–D类)显示细胞周期分布的典型流式细胞术直方图。(A类)修剪32+/+和(B类)修剪32–/–生长培养基中的成肌细胞。(C)修剪32+/+和(D类)修剪32–/–细胞在分化培养基中培养16小时。G公司1/G公司0、S和G2/显示了M个峰值。G的位置1和G2峰值分别用第一个和第二个箭头表示。FL，荧光；RFU，相对荧光单位。(E类)除法百分比（div）（S+G2/M） 和非分割（非iv）（G1/G公司0)计算细胞。值表示至少3个独立实验的平均值±SEM(*P（P）< 0.05). (F类)G的位置1和G2峰值（用箭头显示A类–D类)在PI荧光轴上向左移动修剪32–/–文化。数据汇总并表示为3个独立实验±SEM的平均值(*P（P）< 0.05).
图7
图7。早衰修剪32–/–成肌细胞。
(A类)的缩微照片修剪32+/+和修剪32–/–原代成肌细胞培养物进行SA-β-gal活性染色（蓝色染色）。比例尺：20μm。(B类)在20个独立视野中对SA-β-gal阳性细胞进行计数。数据表示为总细胞数的百分比，并显示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05). (C)Western blot分析显示PIAS4（显示2个blot）、HP1γ和p53在生长培养基中的肌源性细胞中的表达，以及在切换到分化培养基后的不同指示时间。结蛋白印迹显示为加载控制。印迹下的数字是根据载荷标准化的密度测定数据，代表指示蛋白质表达的倍数差异修剪32–/–单元格相对于相应的修剪32+/+文化。(D类)实时PCR分析皮亚斯4使用从修剪32+/+和修剪32–/–生长培养基中的成肌细胞。数据显示为平均值±SEMGapdh公司和皮亚斯4显示了使用qPCR引物的PCR。
图8
图8。PIAS4和sumoylated蛋白在修剪32–/–细胞。
(A类和B类)用50μM蛋白酶体活性抑制剂MG132处理原代肌细胞1、3或6小时。标记为“0”的车道所代表的细胞单独用DMSO（车辆）处理6小时。MG132处理6小时对细胞具有毒性作用，表现出明显的细胞死亡迹象（大多数细胞变圆并分离）。(A类)使用抗PIAS4、抗泛素、抗SUMO-1和抗SUMO-2/3抗体对处理过的细胞进行Western blot分析。文丘林显示为加载控件。请注意，由于细胞毒性，MG132中代表6小时的车道中的带宽密度减少。(B类)归一化为vinculin相对于车辆处理的密度测定数据修剪32+/+值，显示为平均值±sem(*P（P）< 0.05). (C)使用siRNA靶向的RNAi皮亚斯4或成肌细胞培养中的非靶向控制。Western blot分析显示肌源性细胞中PIAS4、HP1γ、p53和SUMO-2/3的表达。Ponceau S染色斑点显示为加载控制。印迹下的数字是根据载荷标准化的密度测定数据，表示成肌细胞中指示的蛋白质表达相对于修剪32+/+用非靶向对照siRNA处理培养物。注意，星号表示未结合的游离SUMO-2/3；只有结合的SUMO物种（如括号所示）用于SUMO-2/3斑点的密度测定。
图9
图9。卫星小区数量减少三分之一32–/–肌肉重新加载时的肌肉。
(A类)用Pax7（显示了2个印迹）和PIAS4对非卧床对照小鼠、暂停5天（悬浮）的小鼠或暂停（重新装载）后重新装载3天的小鼠比目鱼肌提取物的代表性Western blot进行染色。抗结蛋白印迹显示为加载控制。密度测定数据(n个=4）第页，共页(B类)PIAS4和(C)Pax7印迹归一化为结蛋白，显示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05). (D类)冻结段修剪32+/+和修剪32–/–用Pax7对对照组小鼠和悬浮后重新加载3天的小鼠比目鱼肌进行染色。Pax7阳性卫星细胞在显微照片上显示为黑点（示例用箭头表示）。比例尺：50μm。(E类)在每张幻灯片的3个独立视野中定量Pax7阳性细胞的数量。数据(n个=6）表示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05). (F类)流动控制冻结段三分之一32–/–和修剪32+/+用抗快、抗慢肌球蛋白抗体对小鼠进行免疫染色。纤维面积测量显示比目鱼肌快速纤维的平均横截面积显著下降(n个=6）和腓肠肌（胃）(n个=3）肌肉修剪32–/–动物（分别为18.1%和21.04%）。每张幻灯片测量100–300根纤维。数据显示为平均值±SEM(*P（P）< 0.05).
图10
图10。TRIM32在肌营养不良发病机制中的作用。
缺乏E3泛素连接酶TRIM32导致其底物E3 SUMO连接酶PIAS4在骨骼肌中积累。成肌细胞发生过早衰老，表现为生长停滞和衰老标记物浓度增加，如PIAS4底物p53、SA-β-gal、HP1γ和全球sumoylation水平升高。修剪32–/–复制能力降低的卫星细胞无法提供足够的适应性肌肉生长，导致过早的肌细胞减少表型。
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