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.2012年4月12日；74(1):65-78.
doi:10.1016/j.euron.2012.01.031。

谱系内定向Notch信号调节不对称分裂的放射状胶质细胞的自我更新和分化

董志强 1, 南阳, Sang Yeob Yeo, 阿杰·奇尼斯, 苏果（Su Guo）
附属公司

谱系内定向Notch信号调节不对称分裂的放射状胶质细胞的自我更新和分化

董志强等。 神经元. .

摘要

祖细胞/干细胞的不对称分裂产生自我更新和分化的后代，是发育和再生的基础。脊椎动物大脑中这一过程是如何调节的，目前尚不完全清楚。在这里，我们使用延时成像跟踪斑马鱼大脑发育过程中的放射状胶质祖细胞行为。我们发现，不对称分裂总是产生一个基础的自我更新的女儿和一个顶端分化的兄弟姐妹。基因表达和遗传镶嵌分析进一步表明，顶端子代是Notch配体的来源，对于保持基底子代中较高的Notch活性至关重要。值得注意的是，这种谱系内和定向Notch信号的建立需要内在极性调节剂分区缺陷蛋白-3（Par-3），它将命运决定因子“心灵炸弹”不平等地与顶端女儿隔离，从而限制了基础女儿的自我更新潜能。这些发现以单细胞分辨率揭示了自我更新和分化如何在不对称分裂的神经祖细胞/干细胞谱系中精确分离。

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数字

图1
图1。体内发育中的斑马鱼前脑放射状神经胶质祖细胞的延时成像描绘了自我更新和分化分裂
（A） 左图：电穿孔示意图。右图：28 hpf斑马鱼前脑中标记的单个放射状胶质细胞的代表性图像。（B） 延时选定图像的典型蒙太奇体内单个荧光标记的母细胞的成像。左侧的子细胞经历分化分裂（产生两个神经元），而右侧的子细胞则经历自我更新分裂（产生一个祖细胞和一个神经元）。白色虚线表示顶部（底部）和底部（顶部）表面。时间显示在每个面板的顶部。0 h 00 min等于延时开始体内成像（28 hpf）。m： 母细胞，ad：维持较高顶端位置的顶端子细胞，bd：迁移至并维持较高基底位置的基底子细胞，gd：孙女细胞。比例尺，10μm。（C） 描绘母细胞位置的斑马鱼前脑Nomarski图像（A-P，前后；M-L，内侧-外侧）。颜色代表不同的细胞命运谱系，如（D）所示。（D） 通过延时观察到的不同克隆类型体内成像。另请参见图S1和电影S1。
图2
图2。体内延时成像结合克隆分析显示，自我更新的子细胞比分化的兄弟细胞迁移更为基础
（A） 成对子细胞中自我更新和分化兄弟姐妹相对最大基底迁移的量化***第页<0.001，t检验。数据显示为平均值±SEM。（B）斑马鱼前脑的Nomarski图像，描绘了产生21对子细胞的母细胞的位置，显示了不同的细胞命运。（C） 自我更新子细胞（深绿色）和分化子细胞（浅绿色）的相对最大基底迁移。另请参见图S2。
图3
图3。Notch信号成分在斑马鱼脑发育中的表达
荧光原位杂交（FISH）显示dla公司（绿色；A），缺口1b（绿色；C）和她的4.1（绿色；D）在36 hpf胚胎中。荧光免疫组化显示Dld蛋白（红色；B）在36 hpf胚胎中的表达。Hu（红色）标记有丝分裂后神经元，β-连环蛋白（蓝色）描绘胚胎的轮廓。fb：前脑，v：心室，mb：中脑。
图4
图4。基底子细胞表达更高水平的her4.1（her4.1）
（A至D）鱼类her4.1（her4.1）（红色）结合前脑配对子细胞中GFP（绿色）和β-连环蛋白（蓝色）的免疫组织化学。根据基底子细胞到心室表面的距离组合图像。TNT：神经上皮总厚度。黄色方框区域的放大图显示在每个面板的右侧。五： 心室。（E–F）FISH信号的量化her4.1（her4.1）在条形图（E）或散点图（F）中显示的成对子单元中***第页< 0.001与顶端，t检验。（G–H）her4.1（her4.1）分裂期间（G）或分裂后不久（H）前脑祖细胞中的表达。五： 心室，a：前，p：后。（I–J）条形图（I）或散点图（J）中（G–H）的量化。（K） 延时选定图像的典型蒙太奇体内后脑单个EGFP标记的母细胞成像her4:dRFP转基因胚胎。m： 母细胞，d：子细胞。比例尺，10μm。另请参见图S3和电影S2。
图5
图5。顶端子细胞表达较高水平的dla公司
（A–D）鱼类dla公司（红色）结合前脑配对子细胞中GFP（绿色）和β-连环蛋白（蓝色）的免疫组织化学。TNT：神经上皮总厚度；五： 心室。（E） 条形图（E）和散点图（F）中（A–D）的量化***第页< 0.001与顶点，t检验。（G和H）dla公司在（G）期间或分裂后不久的表达（H）。五： 心室，a：前，p：后。（一） 条形图（I）和散点图（J）中（G–H）的量化。另请参见图S4。
图6
图6。克隆击倒dla公司揭示了非对称分裂子细胞的线内Notch信号
（A） 示意图描绘了两种不同的Notch信号模式。左：侧抑制。右：线内。（B） 移植策略概述。（C） 单个4细胞克隆的代表性图像。Inset是红色虚线框高亮显示的区域的放大。（D） 对照吗啉组（上图）和dla公司吗啉组（底部）。对照组中，两个单一的4细胞克隆包含一个前体细胞和三个神经元孙女细胞。在dla公司吗啉组，两个单一的4细胞克隆包含四个神经元孙女细胞。（E） D的量化**第页< 0.01, ***第页< 0.001与Ctrl MO，z测试。另请参见图S5。
图7
图7。命运决定因子Mib以Par-3-依赖的方式与顶端子代不相等地分离
（A） Mib-GFP在膜靶向myr:tdTomato的细胞质中检测到。（B） Mib-GFP在核报告子H2B:mRFP附近被检测到。（C） Mib-GFP与Dld共同定位。（D） Mib-GFP不均匀地分离为顶端子代。（E） 通过敲除par-3消除mib-GFP的不均匀分离。（F） 延时实时成像的选定帧显示在分裂期间Mib-GFP与顶端子细胞的不均匀分离。（G） 延时实时成像的选定帧显示，在细胞分裂期间，Mib-GFP在两个子细胞中的分布相等第3段变体。另请参见图S6、电影S3和电影S4。
图8
图8。Par-3对于限制基础女儿的Notch活动至关重要，从而限制自我更新
（A–F）her4.1（her4.1）（A–B）或dla公司（D–E）在对照组（A，D）和第3部分（B，E）变体。（C） 和（F）是量词***第页< 0.001与顶点，t检验。（G–L）的表达式her4.1（her4.1）（G–H）、Hu（I–J）和dla公司（K–L）处于控制状态（G、I、K）或第3部分变体（H，J，L）。（M） 定量RT-PCR显示her4.1（her4.1）,她的6,dla公司,数字图书馆,缺口1a和缺口1b控制中与第3部分变体*第页<0.05时**第页< 0.01,与进行了与图5B所示类似的Ctrl-MO（N-R）移植。来自对照（N）或第3部分其他野生型大脑中的变体（O–Q）。对照组中，单个克隆由1个前体细胞（红色）和3个神经元（绿色）组成，而第3部分–缺陷克隆包含更少的神经元（绿色）和更多的祖细胞（红色）。（R） N–Q的量化**第页< 0.01,与Ctrl MO，Z测试。（S） 不对称分裂的放射状胶质细胞祖细胞调控自我更新和分化的模型。参见讨论。另请参见图S7。
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