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.2012年5月；139(9):1557-67.
doi:10.1242/dev.076000。

不同水平的Notch信号调节胰腺内分泌祖细胞的静止、更新和分化

尼古拉·尼诺夫 1, 马克西姆·鲍里乌斯, 迪迪埃·Y·R·斯坦尼尔
附属公司

不同水平的Notch信号调节胰腺内分泌祖细胞的静止、更新和分化

尼古拉·尼诺夫等。 开发. 2012年5月.

摘要

遗传学研究表明Notch信号与胰腺祖细胞的维持有关。然而，Notch信号如何在单细胞水平调节胰腺祖细胞的静止、增殖或分化行为尚不清楚。在这里，我们利用单细胞遗传分析和一种新的转基因系统，对Notch信号进行动态评估，研究Notch信号的离散水平如何调节斑马鱼胰管内内分泌祖细胞的行为。我们发现这些祖细胞经历不同水平的Notch信号传导，进而调节不同的细胞结果。高水平的Notch信号诱导静息，而低水平的Notch信号促进祖细胞扩增。Notch信号的持续下调触发了一个多步骤过程，包括内分泌分化前的细胞周期进入和祖细胞扩增。重要的是，祖细胞扩增和分化可以通过调节Notch信号下调的持续时间和/或程度来解耦，这表明这些过程是由不同水平的Notch信号触发的。这些数据表明，不同水平的Notch信号在祖细胞群体中驱动不同的行为。

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数字

图1。
图1。
Notch信号的不同水平决定了NRC的不同或静止状态。(A类)Tg（Tp1:H2Bm樱桃）驱动H2BmCherry在NRC中的表达，其半衰期很长。Tg（Tp1：病毒有害物）驱动NRC中半衰期短的不稳定VenusPEST荧光蛋白的表达。具有激活Notch信号的细胞是Tg（Tp1：H2Bm樱桃)+和Tg（Tp1：静脉害虫)+。具有激活Notch信号但丢失Notch信号的细胞是Tg（Tp1：H2Bm樱桃)+但是Tg（Tp1：静脉害虫)–(补充材料图S1A-C，图S2）。(B-D公司″)Tg（Tp1:H2Bm樱桃）；Tg（Tp1：病毒有害物）将幼虫固定在进行性发育阶段，并对其进行胰岛素染色以显示β细胞。NRC经历细胞形状变化、迁移和增殖以构建IPD。（D-D“）在4.5 dpf时，一对β细胞（白色箭头）沿IPD形成了一个次级胰岛。为了更好地显示这些细胞，在D′，D〃中显示了一个高倍率的单平面，带有单独的通道。两个β-细胞（箭头）是Tg（Tp1：H2Bm樱桃)+但是Tg（Tp1：静脉害虫)–，表明它们起源于关闭Notch信号的NRC。(E类,E’)Tg（Tp1:H2Bm樱桃）；Tg（Tp1：病毒有害物）幼虫被固定并在5.5dpf下进行检测。图中显示了穿过IPD的单个平面。根据荧光强度Tg（Tp1：静脉害虫)表达式，NRC是Tg（Tp1：静脉害虫)你好（黄色箭头），Tg（Tp1：静脉害虫)低的（白色箭头）或Tg（Tp1：静脉害虫)–（箭头），表示它们经历了不同级别的Notch信号。(F类,F’)实时成像Tg（Tp1:H2Bm樱桃）;Tg（神经元：EGFP）幼虫在3.5dpf。Tg（Tp1：H2Bm樱桃)表达式标签NRC（红色）和Tg（神经：表皮生长因子)表达标记内分泌细胞及其直接祖细胞（绿色）。白色箭头表示内分泌细胞分化。黄色箭头表示随着时间的推移，单个NRC会上调Tg（神经：表皮生长因子)表达，提示内分泌谱系分化开始。由于胰腺的形态发生，细胞的位置会随着时间而改变。(G-G公司″)Tg（TP1:H2BmCherry）;Tg（TP1:VenusPEST）幼虫与EdU孵育4至5 dpf，用于细胞周期分析。黄色箭头表示Tg（TP1：静脉PEST)你好NRC；大多数是EdU–而相邻NRC的Tg（TP1：静脉PEST)表达式为EdU+（白色箭头）。(H（H）)平均值Tg（TP1：静脉PEST)计算163 EdU的荧光强度–和109 EdU+NRC（来自四个幼虫的共聚焦堆栈）。EdU幼虫之间的平均荧光强度值（±s.d.）–NRC为148（s.d.=17.4），EdU为+NRC为63.9（标准差=34.2）(P（P）<0.01). 所有图像均为侧视图，前面朝向顶部，腹部朝向右侧。C、D和F中IPD腹侧的NRC是肠细胞。比例尺：20μm。
图2。
图2。
增加Notch信号下调水平导致NRC内分泌分化增加。(A-D公司′)Tg（Tp1:H2Bm樱桃）；Tg（神经元：EGFP）幼虫被用来标记NRC（红色）和内分泌分化（绿色）。用（A）二甲基亚砜（DMSO）、（B）100μM DAPT、（C）10μM LY411575和（D）50μM LY111575从3.5到6.5 dpf处理幼虫，并在7.5 dpf下进行分析。2F11染色标记IPD。（A，A′）根据2F11免疫反应性（箭头）评估，在对照幼虫中，胰腺NRC形成IPD。白色箭头表示IPD沿线的内分泌细胞。（B，B′）在DAPT处理的幼虫中，PI后面的一些NRC分化为内分泌谱系，如以下评估所示Tg（神经：表皮生长因子)表达式（箭头）。通过2F11免疫反应性（箭头）评估，大多数NRC保留了IPD细胞身份，并且没有经历内分泌分化（箭头）。（C，C′）在用10μM LY411575处理的幼虫中，通过2F11免疫反应性（箭头）评估，保留IPD细胞特性的NRC数量较少（与B相比）。请注意，大多数Tg（Tp1：H2Bm樱桃)+分化为内分泌细胞的细胞Tg（神经：表皮生长因子)表达式。箭头表示内分泌细胞。（D，D′）在50μM LY411575处理的幼虫中，绝大多数NRC转化为内分泌细胞Tg（神经：表皮生长因子)表达并聚集成次级胰岛（箭头）。通过2F11免疫反应性评估，IPD网络不存在。(E-G公司'）从杂交获得的幼虫Tg（hsp:Gal4）；Tg（UAS:myc-Notch1a-intra）半合子和Tg（Tp1:H2Bm樱桃）；Tg（神经元：EGFP）鱼在3.5 dpf下受到热休克，诱导myc-Notch1a-intra表达，并在DMSO或10μM LY411575中孵育至6.5 dpf。（E，E′）A二甲基亚砜处理（myc-Notch1a-intra）–幼虫。上箭头，PI；下箭头，IPD。（F，F′）A LY411575治疗（myc-Notch1a-intra）–幼虫有异位的次级胰岛（下箭头）。注意PI的增大尺寸（上箭头；与E相比）。[Tg（神经：表皮生长因子)大脑中的表达也增加了（黄色箭头）。]（G，G′）A（myc-Notch1a-intra）+用LY411575处理幼虫。IPD（下箭头）沿线没有次级胰岛，PI的大小也没有增加（上箭头）。请注意Tg（Tp1：H2Bm樱桃)表达式。(H-I〃′)Tg（Tp1:H2Bm樱桃）幼虫用（H，H′）二甲基亚砜和（I-I〃′）50μM LY411575处理3.5至6.5 dpf，并在7.5 dpf时对胰高血糖素和胰岛素进行染色。在LY411575处理的幼虫中，NRCs在PI后面形成了五个胰岛（箭头）。这些胰岛含有NRC衍生的α和β细胞。（I〃，I〃′）两个小岛的几个平面的高放大投影（关于完整堆栈，请参见补充材料电影4）。I〃中的黄色和白色箭头分别指向α和β细胞。所有图像均为侧视图，前面朝向顶部，腹部朝向右侧。2F11层+,Tg（Tp1：H2Bm樱桃)+和Tg（神经：表皮生长因子)+IPD腹侧的细胞是肠细胞。比例尺：A-D′，H-I′为20μm；E-G中为100μm。
图3。
图3。
Notch信号下调诱导NRC的细胞周期进程，而Notch信号上调触发NRC的静止。(A-C公司)在有EdU的情况下，用DMSO或10μM LY411575处理幼虫，处理时间为4-6 dpf（52小时）。（A） DMSO处理的对照幼虫。黄色箭头表示EdU+NRC；白色箭头表示沿着IPD的两个内分泌细胞（几个平面的投影）。（B） LY411575处理的幼虫的内分泌细胞数量增加。注意，大多数新的内分泌细胞是EdU+（箭头），只有两个内分泌细胞是EdU–（箭头）（几个平面的投影）。然而，当内分泌分化时，NRC退出细胞周期（参见补充材料图S3B、C）。（C） 教育程度平均百分比的量化+蓝条：DMSO对照组中平均43%的NRC为EdU+（7只幼虫计140个细胞）。红条：在LY411575处理的幼虫中，平均85%未经历内分泌分化的NRC是EdU+（7只幼虫计140个细胞）(P（P）<0.001). 绿色条：大多数（65%）新内分泌细胞是EdU+（7只幼虫计129个细胞）。误差线表示s.d(天,E类)幼虫在4.5 dpf下热休克，诱导（D）ZdnSu（H）-myc或（E）myc-Notch1a-intra的镶嵌表达，并在EdU中孵育24小时（4.5至5.5 dpf）。对转基因阳性或阴性的细胞进行EdU掺入评分。（D） （ZdnSu（H）-myc）+通过GFP表达鉴定细胞(补充材料图S4A）。黄色箭头表示五个GFP+NRC，所有这些都是教育部+.邻近GFP–NRC（白色箭头）随机合并EdU（几个平面的投影）。GFP的81%+NRC是EdU+（52只幼虫中有104个细胞），而GFP的42%–NRC是EDU+（9只幼虫中有351个细胞）。（E） Myc染色标记Myc-Notch1in-tra过表达细胞（红色）和Tg（Nkx2.2a：GFP公司)表达标记IPD细胞（绿色）。Myc公司+IPD单元为EdU–（黄色箭头）。EdU公司仅限于邻近的Myc-IPD单元（白色箭头）（几个平面的投影）。所有图像均为侧视图，前面朝向顶部，腹部朝向右侧。比例尺：20μm。
图4。
图4。
通过调节Notch信号下调的持续时间和/或程度，可以解除祖细胞扩增和分化的耦合。(A至B′)Tg（Tp1:H2Bm樱桃）幼虫被用来标记NRCs（红色）。用DMSO或10μM LY411575处理幼虫，处理剂量为4至4.5 dpf。在4.5 dpf时，化学物质被冲走，EdU从4.5添加到5.5 dpf以进行细胞周期分析。EdU的位置+NRC用白色轮廓表示。与对照组相比，LY411575的短暂治疗足以诱导大多数NRC进入细胞周期。(C类)教育程度平均百分比+A和B中的NRC（±标准差）。四十Tg（Tp1：H2Bm樱桃)+从胰腺后部开始计算每个幼虫的细胞数(n个=DMSO和n个=LY411575的12只幼虫）。在DMSO控制中，平均23%的NRC为EdU+，而在LY411575处理的幼虫中，平均69%是EdU+(P（P）<0.001). (D-F公司)Tg（Tp1:H2Bm樱桃）；Tg（神经元：EGFP）用（D）DMSO或（E，F）10μM LY411575处理幼虫。（E） 用LY411575处理幼虫，处理剂量为4至4.5 dpf。4.5 dpf时，LY411575被冲走，并允许动物发育到7 dpf。平均而言，PI后面有12个内分泌细胞（s.d.=4个细胞，n个=8只幼虫），转化为胰腺尾部约14%的NRC分化为内分泌谱系。DMSO对照组显示平均1个内分泌细胞（s.d.=1个细胞，n个=7只幼虫）。箭头表示NRC衍生的内分泌细胞。箭头表示Tg（神经：表皮生长因子)+肠道中的细胞。（F） 用LY411575处理幼虫，处理剂量为4-7 dpf。白色箭头表示三个由众多内分泌细胞组成的新胰岛。只有两个NRC没有经历内分泌分化（黄色箭头）。(G-H公司'）诱导适度的Notch信号下调，Tg（Tp1:H2Bm樱桃）；Tg（神经元：EGFP）用（G）二甲基亚砜或（H，H′）1μM LY411575处理幼虫，处理剂量为4-7dpf。在每种情况下，每24小时更换一次化学品。用1μM LY411575（H，H′）处理的幼虫，其总的Tg（Tp1：H2Bm樱桃)+PI后面的细胞（黄色箭头）（118个细胞，s.d.=21个细胞，n个=20只幼虫）与DMSO对照组（71个细胞，s.d.=19个细胞，n个=18只幼虫）(P（P）<0.0001). NRC衍生内分泌细胞平均占17%（s.d.=7.26%，n个=19只幼虫）Tg（Tp1：H2Bm樱桃)+PI后面的细胞（白色箭头）（另请参见补充材料图S5A、B、D为低倍视图和数据量化）。所有图像均为侧视图，前面朝向顶部，腹部朝向右侧。比例尺：20μm。(我)NRC经历不同水平的Notch信号调节其静止、增殖或分化状态。(J)Notch信号下调后，NRC（红色）进入细胞周期。在Notch信号的持续下调下，它们分化为内分泌细胞并退出细胞周期。一些NRC可以在不进入细胞周期的情况下直接分化；一些NRC即使在短暂和/或中度Notch信号下调后也会分化为内分泌细胞。
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