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.2012年9月；56(3):1108-16.
doi:10.1002/hep.25758。

骨桥蛋白是SOX9的一个新的下游靶点，对人类肝纤维化的进展具有诊断意义

詹姆斯·普里切特 1, 艾玛·哈维, Vander Athwal公司, 安德鲁·贝瑞, 克利夫·罗, 菲奥娜·奥克利, 安娜·莫尔斯, 德里克·阿曼, 尼科莱塔·波波拉, 安德鲁·D·沙罗克斯, 布莱恩·汤姆森, Abed M Zaitoun先生, 威廉·欧文, Indra N Guha公司, 尼尔·A·汉利, 凯伦·派珀-汉利
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骨桥蛋白是SOX9的一个新的下游靶点，对人类肝纤维化的进展具有诊断意义

詹姆斯·普里切特等人。 肝病学. 2012年9月.
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摘要

骨桥蛋白（OPN）是细胞外基质（ECM）的重要组成部分，可促进肝纤维化，并被描述为肝纤维化严重程度的生物标志物。以前，我们已经证明，性别决定区Y-box 9（SOX9）在肝星状细胞（HSC）激活期间外显表达，当其负责生成1型胶原时，会导致肝纤维化形成瘢痕。在这里，我们证明SOX9调节OPN。在正常发育和成熟肝脏中，SOX9和OPN在胆管中共存。在啮齿类动物和人类的纤维化模型中，这两种蛋白质在体内和培养物激活的HSC中都增加并共同定位到纤维化区域。SOX9结合了OPN基因的保守上游区域，HSC中SOX9的去除显著降低了OPN的产生。Hedgehog（Hh）信号曾被证明通过胶质母细胞瘤（GLI）1直接调节OPN表达。我们的数据表明，在肝纤维化模型中，Hh信号更有可能通过SOX9调节OPN。与Gli2和Gli3相比，Gli1在HSC中是稀疏的，激活后不会增加。此外，GLI2（而非GLI3）的减少降低了SOX9和OPN的表达，而SOX9或组成活性GLI2的过度表达可以缓解环胺对OPN表达的拮抗作用。

结论：这些数据强化了Hh信号传导下游的SOX9，作为介导参与肝纤维化的ECM成分表达的核心因子。了解SOX9在肝纤维化过程中的作用和调节，将有助于深入了解其作为抗纤维化治疗或识别潜在ECM靶点（类似于OPN）作为纤维化生物标志物的潜在调节作用。

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图1
图1
健康肝脏中SOX9和OPN的IHC。大鼠和人类（受孕18周[wpc]和成年期）健康肝脏的连续5μm切片进行SOX9和OPN（棕色）染色，并用托洛定蓝进行复染。注意，仅在胆道上皮细胞的圆形细胞核（SOX9）和细胞质（OPN）中检测到。尺寸条代表50μm。
图2
图2
纤维化肝脏中SOX9、OPN和结蛋白的IHC。（A） 大鼠和小鼠纤维化组织中的双重IF在胆道细胞（星号）和结蛋白细胞质染色细胞（绿色）（白色箭头）中显示核Sox9（红色）。（B） 用Sox9和Opn（棕色）染色的纤维化大鼠和小鼠肝脏连续5μm组织切片用甲苯胺蓝复染。请注意，Sox9和Opn在具有更多纺锤形细胞核的细胞（箭头）以及胆道细胞（星号）中的位置类似。尺寸条代表100μm。
图3
图3
激活HSC中SOX9和OPN的表达。（A-E）通过qPCR（A和C）和免疫印迹（B、D和E）定量静止和活化的rHSC和LX2细胞中的SOX9和OPN（在[A]中，Sox9指数上调了8.0倍）。在（B）中，Sox9、Opn和Col1的诱导是在培养物中rHSC激活期间显示的（相对于静止状态；第0天）。（B）和（D）的代表性免疫印迹图像分别显示为插图（B）或单个图像（E）。所有免疫印迹定量均归一化为β-肌动蛋白*P（P）< 0.05; †P（P）<0.005，与静止第0天的细胞（A和B）或0%的血清（C和D）相比。
图4
图4
激活的hHSC和rHSC中SOX9和OPN的表达。在大鼠和人类激活的HSC（aHSC）中，IF显示核SOX9（红色）和细胞质α-SMA（绿色；左侧面板）或OPN（绿色；右侧面板）。尺寸条代表20μm。
图5
图5
SOX9对HSC中OPN的调节。（A-C）消除激活的rHSC（A和B）和LX2细胞（C）中Sox9的siRNA，以防干扰mRNA（A）和蛋白质（B和C）的siRNA控制。免疫印迹示例如（B）和（C）所示*p<0.05**P（P）< 0.01; †P（P）< 0.005; ‡P（P）<0.001，与对照组相比。（D） 上游线路OPN公司具有保守SOX9-结合基序的增强子区域以黑色突出显示（显示的人类序列相对于转录起始点为−3886到−3842碱基对）。用星号（*）表示的保守核苷酸。核心SOX结合基序是CAAT，通过额外的侧翼核苷酸对SOX9具有更强的结合亲和力。（E） 保守上游SOX9-结合元件的ChIP分析OPN公司高血清培养的LX2细胞和活化的rHSC中的增强因子。阴性对照为免疫球蛋白G（IgG），阳性对照为输入（稀释10倍）。
图6
图6
Hh调节HSC中SOX9和OPN的表达。（A-D）用Hh拮抗剂CYC或Hh激动剂SAG处理24小时后，从活化的rHSC和LX2细胞的免疫印迹中定量的SOX9和OPN蛋白水平。（E） 在LX2细胞中，用SAG处理24小时并用siRNA或干扰对照击倒SOX9（87%）后，SOX9和OPN的蛋白质水平。（F） 在有或无CYC的LX2细胞中SOX9过度表达后OPN蛋白的定量。插图中显示的免疫印迹图像示例。在所有实验中，将表达变化与载体处理细胞（DMSO）进行比较，在（F）的情况下，将EV控制。针对β-肌动蛋白的实验标准化*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; †P（P）< 0.005; ‡P（P）<0.001，与对照组相比。
图7
图7
Gli2介导HSC中Sox9和Opn的表达。（A） 的表达式格利qPCR检测静止和活化rHSC中的因子。（B和C）在LX2细胞中用于GLI2（B，67%敲除）和GLI3（C，86%敲除）的siRNA或扰乱对照，随后用于GLI2（B）或GLI3（C）、SOX9和OPN的qPCR*P（P）< 0.05; †P（P）< 0.005; ‡P（P）<0.001，与干扰siRNA处理相比。
图8
图8
Gli2过表达挽救了CYC对HSC中Sox9和Opn表达的拮抗作用。（A-D）在存在或不存在CYC的LX2细胞中过表达组成活性GLI2（GLI2ΔN；A和B）或活性GLI3（GLI3A；C和D）后SOX9和OPN蛋白的定量。（E） IF在活化的rHSC（aHSC）中显示核Gli2（红色）和细胞质α-Sma（绿色），在CCl中显示亮场IHC显示核Gll2（棕色染色）4-治疗纤维化大鼠肝脏。箭头表示胆管中Gli2的表达*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; †P（P）< 0.005, ‡P（P）<0.001，与EV转染相比。尺寸条代表20μm。
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